Utilización de Grafix para la detección de interactores transitorios de subcomplejos de Saccharomyces cerevisiae Spliceosome

Summary

Aquí, describimos la utilización de Grafix (Gradient Fixation), una centrifugación de gradiente de glicerol en presencia de un ticulador, para identificar interacciones entre factores de empalme que se unen transitoriamente al complejo de espliceosomas.

Abstract

El empalme pre-ARNm es un proceso muy dinámico que implica muchos reordenamientos moleculares de los subcomplejos del espliceosoma durante el ensamblaje, el procesamiento del ARN y la liberación de los componentes complejos. La centrifugación por gradiente de glicerol se ha utilizado para la separación de complejos de proteínas o RNP (RiboNucleoProtein) para estudios funcionales y estructurales. Aquí, describimos la utilización de Grafix (Gradient Fixation), que se desarrolló por primera vez para purificar y estabilizar complejos macromoleculares para microscopía crio-electrónica de partículas individuales, para identificar interacciones entre factores de empalme que se unen transitoriamente al complejo de espliceosomas. Este método se basa en la centrifugación de muestras en una concentración creciente de un reactivo de fijación para estabilizar complejos. Después de la centrifugación de los extractos totales de levadura cargados en gradientes de glicerol, las fracciones recuperadas se analizan por punto blot para la identificación de los sub-complejos de espliceosomas y la determinación de la presencia de factores de empalme individuales.

Introduction

El empalme es un proceso altamente dinámico que requiere la unión y liberación de una multitud de factores de manera coordinada. Estos factores de empalme incluyen proteínas de unión a ARN, ATPasas, helicasas, proteínas quinasas y fosfatasas, ligasas de ubiquitina, entre otras^1,2,3; y para permitir que se produzcan los reordenamientos moleculares, algunos de estos factores se unen muy transitoriamente a los subcomplejos del espliceosoma, lo que hace que el aislamiento y la identificación de estos complejos intermedios de RNP sean muy difíciles.

Aquí, utilizamos el método grafix^4,5 para estabilizar la interacción del factor de empalme de levadura Cwc24 con el complejo de^acto B⁶ para permitir la identificación de otros factores unidos concomitantemente a ese subcomplejo y determinar si la ubiquitina ligasa Prp19 juega algún papel en la unión o liberación de Cwc24 al complejo Nineteen (NTC) y al extremo 5′ del intrón antes de la activación y la primera reacción de transesterificación toma lugar. La ventaja de exponer las macromoléculas a una concentración creciente del reticulador a lo largo del gradiente de glicerol es que evita los enlaces cruzados inter-complejos^4,5y, por lo tanto, la formación de agregados.

Este método se utilizó como complemento a los ensayos de coinmunoprecipitación de proteínas y pull-down, que, a pesar de permitir el aislamiento de grandes complejos, pueden no ser confiables para mantener interacciones transitorias dentro de grandes complejos dinámicos^7,8. El uso de reactivos de fijación en el gradiente de glicerol estabiliza la unión de dichos factores, permitiendo la confirmación de interacciones de proteínas específicas con subcomplejos de empalme. Debido a que el reticulador elegido era químicamente irreversible, las proteínas presentes en las fracciones recuperadas se analizaron mediante puntos secantes después de la centrifugación por gradiente.

Protocol

1. Preparación de extracto total de levadura Cultivar las células de levadura expresando uno de los factores de empalme fusionados a la etiqueta TAP9 en medios 1 L YNB-glu (Base de Nitrógeno de Levadura suplementada con 2% m/v de glucosa) con los aminoácidos o bases nucleicas apropiadas, en este caso, adenina (20 μg/mL), leucina (30 μg/mL), triptófano (30 μg/mL), hasta OD600 = 1.0. Recoger las células del cultivo de 1 L centrifugando en tres botellas centrí…

Representative Results

Para analizar el perfil de sedimentación de Cwc24-TAP y determinar si el método Grafix fue efectivo para estabilizar su unión a subcomplejos de empalme, separamos extractos de levadura total de células que expresan Cwc24-TAP mediante centrifugación en gradientes de glicerol, en presencia o ausencia de glutaraldehído como agente de reticulación. Las muestras de veinticuatro fracciones de 500 μL se analizaron mediante ranura blot con anticuerpos contra la porción CBP de la etiqueta TAP. Los resultados muestran que…

Discussion

Las interacciones proteína-proteína y ácidos ribonucleicos-proteína se pueden estabilizar utilizando agentes ticuladores. Es importante que el complejo resultante sea estable para soportar la ultracentrifugación en el gradiente de glicerol. Además, las condiciones del búfer deben permitir la interacción, pero ser lo suficientemente estrictas como para evitar la unión no específica. En los experimentos aquí mostrados, utilizamos una solución tampón ya establecida para reacciones de empalme in vitro<sup class=…

Materials

Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope	Millipore	07-482
ECL anti-Rabbit IgG	GE Healthcare	NA934
EconoSystem	Bio-Rad	1-800-424-6723	Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11873580001
Fraction Recovery System	Beckman Coulter	270-331580	Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem
Gradient Master Model 107ip	Biocomp	107-201M
Mixer Mill MM 200	Retsch	207460001	Ball Mill device
Rotor F12-6x500Lex	Thermo Scientific	096-062375
Sorvall RC 6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific	36-101-0816
Swinging Bucket Rotor P40ST	Hitachi
Ultracentrifuge CP 80 NX	Hitachi	901069
Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm)	Beckman Coulter	344059