Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes Geçici Interactors Tespiti için Grafix kullanımı
Summary
Burada, bir çapraz bağlayıcı varlığında gliserol gradyan santrifüjleme olan Grafix’in (Gradyan Fiksasyonu), spliceosome kompleksine geçici olarak bağlanan birleştirme faktörleri arasındaki etkileşimleri tanımlamak için kullanımını açıklıyoruz.
Abstract
Pre-mRNA birleştirme, karmaşık bileşenlerin montajı, RNA işlemesi ve serbest bırakılması sırasında spliceosome alt komkomplexlerinin birçok moleküler yeniden düzenlenmesini içeren çok dinamik bir süreçtir. Gliserol gradyan santrifüjleme fonksiyonel ve yapısal çalışmalar için protein veya RNP (RiboNucleoProtein) komplekslerinin ayrılması için kullanılmıştır. Burada, ilk olarak tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskopisi için makromoleküler kompleksleri arındırmak ve stabilize etmek, spliceosome kompleksine geçici olarak bağlanan birleştirme faktörleri arasındaki etkileşimleri tanımlamak için geliştirilen Grafix’in (Gradyan Fiksasyonu) kullanımını açıklıyoruz. Bu yöntem, kompleksleri stabilize etmek için numunelerin artan bir sabitleme reaktif konsantrasyonuna santrifüjlenmesine dayanmaktadır. Gliserol gradyanlarına yüklenen maya toplam özlerinin santrifüjlenmesinden sonra, geri kazanılan fraksiyonlar spliceosome alt komplekslerinin tanımlanması ve bireysel birleştirme faktörlerinin varlığının belirlenmesi için nokta lekesi ile analiz edilir.
Introduction
Birleştirme, çok sayıda faktörün koordineli bir şekilde bağlanmasını ve serbest bırakılmasını gerektiren son derece dinamik bir işlemdir. Bu birleştirme faktörleri arasında RNA bağlayıcı proteinler, ATPases, helicases, protein kinazları ve fosfatazlar, ubiquitin ligases, diğerleri arasında1,2,3; ve moleküler yeniden düzenlemelerin gerçekleşmesine izin vermek için, bu faktörlerin bazıları çok geçici olarak spliceosome alt komitelerine bağlanır ve bu RNP ara komplekslerinin izolasyonu ve tanımlanmasını çok zorlaştırır.
İşte, Grafix yöntemi4,5’i, maya birleştirme faktörü Cwc24’ün Bact complex6 ile etkileşimini stabilize etmek için kullandık, bu alt sıkıştırıcıya birlikte bağlı diğer faktörlerin tanımlanmasına izin vermek ve ubiquitin ligase Prp19, Cwc24’ün on dokuz (NTC) kompleksine bağlanmasında veya serbest bırakılmasında ve aktivasyondan önce intronun 5′ ucuna kadar herhangi bir rol oynar ve ilk transesterifikasyon reaksiyonu alır yer. Makromolekülleri gliserol gradyanı boyunca artan bir çapraz bağlantı konsantrasyonuna maruz kalmanın avantajı, kompleksler arası çaprazbağlantılardan 4,5ve dolayısıyla agregaların oluşumunu önlemesidir.
Bu yöntem, büyük komplekslerin izolasyonuna izin vermesine rağmen, büyük dinamik kompleksler içinde geçici etkileşimleri sürdürmek için güvenilir olmayabileceği protein koimmunoprecipitation ve çekme tahlillerinin tamamlayıcısı olarak kullanılmıştır7,8. Gliserol gradyanındaki fiksasyon reaktiflerinin kullanımı, bu faktörlerin bağlanmasını stabilize ederek, belirli proteinlerin birleştirme altcomplexes ile etkileşimlerinin onaylanmasını sağlar. Seçilen çapraz bağlantı kimyasal olarak geri döndürülemez olduğundan, geri kazanılan fraksiyonlarda bulunan proteinler gradyan santrifüjlemeden sonra nokta lekesi ile analiz edildi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protein-protein ve ribonik asitler-protein etkileşimleri çapraz bağlama ajanları kullanılarak stabilize edilebilir. Elde eden kompleksin gliserol gradyanı üzerinde ultrasantrifüjasyona dayanacak şekilde kararlı olması önemlidir. Ayrıca, arabellek koşulları etkileşime izin vermeli, ancak belirli olmayan bağlamayı önlemek için yeterince katı olmalıdır. Burada gösterilen deneylerde, in vitro birleştirme reaksiyonları için önceden kurulmuş bir tampon çözeltisi kullandık15</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma bir FAPESP hibesi (15/06477-9) tarafından desteklendi.
Materials
| Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope | Millipore | 07-482 | |
| ECL anti-Rabbit IgG | GE Healthcare | NA934 | |
| EconoSystem | Bio-Rad | 1-800-424-6723 | Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector |
| EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| Fraction Recovery System | Beckman Coulter | 270-331580 | Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem |
| Gradient Master Model 107ip | Biocomp | 107-201M | |
| Mixer Mill MM 200 | Retsch | 207460001 | Ball Mill device |
| Rotor F12-6x500Lex | Thermo Scientific | 096-062375 | |
| Sorvall RC 6 Plus Centrifuge | Thermo Scientific | 36-101-0816 | |
| Swinging Bucket Rotor P40ST | Hitachi | ||
| Ultracentrifuge CP 80 NX | Hitachi | 901069 | |
| Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344059 |
References
- Kastner, B., Will, C. L., Stark, H., Lührmann, R. Structural insights into nuclear pre-mRNA splicing in higher eukaryotes. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (11), 032417 (2019).
- Yan, C., Wan, R., Shi, Y. Molecular mechanisms of pre-mRNA splicing through structural biology of the spliceosome. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032409 (2019).
- Cordin, O., Hahn, D., Beggs, J. D. Structure, function and regulation of spliceosomal RNA helicases. Current Opinion in Cell Biology. 24, 431-438 (2012).
- Kastner, B., et al. GraFix: sample preparation for single-particle electron cryomicroscopy. Nature Methods. 5 (1), 53-55 (2008).
- Stark, H. Grafix: stabilization of fragile macromolecular complexes for single particle cryo-EM. Methods in Enzymology. 481, 109-126 (2010).
- Yan, C., Wan, R., Bai, R., Huang, G., Shi, Y. Structure of a yeast activated spliceosome at 3.5 Å resolution. Science. 353 (6302), 895-904 (2016).
- Ohi, M. D., et al. Proteomics analysis revelas stable multiprotein complexes in both fission and budding yeasts containing Myb-related Cdc5p/Cef1p, novel pre-mRNA splicing factors, and snRNAs. Molecular and Cellular Biology. 22 (7), 2011-2024 (2002).
- Lourenco, R. F., Leme, A. F. P., Oliveira, C. C. Proteomic analysis of yeast mutant RNA exosome complexes. Journal of Proteome Research. 12 (12), 5912-5922 (2013).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterizatioin and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17, 1030-1032 (1999).
- Cheng, S. C., Newman, A., Lin, R. J., McFarland, G. D., Abelson, J. N. Preparation and fractionation of yeast splicing extract. Methods in Enzymology. 181, 89-96 (1990).
- Umen, J. G., Guthrie, C. A novel role for a U5 snRNP protein in 3′ splice site selection. Genes & Development. 9, 855-868 (1995).
- Dunn, E. A., Rader, S. D., Hertel, K. J. Preparation of yeast whole cell splicing extract. Spliceosomal Pre-mRNA Splicing: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 1126, 123-135 (2014).
- Hill, H. D., Straka, J. G. Protein determination using bicinchoninic acid in the presence of sulfhydryl reagents. Analalytical Biochemistry. 170 (1), 203-208 (1988).
- Cepeda, L. P., et al. The ribosome assembly factor Nop53 controls association of the RNA exosome with pre-60S particles in yeast. The Journal of Biological Chemistry. 294 (50), 19365-19380 (2019).
- Lin, R. J., Newman, A. J., Cheng, S. C., Abelson, J. Yeast mRNA splicing in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 260 (27), 14780-14792 (1985).
