Summary
Questo protocollo utilizza un test di immunofluorescenza per rilevare danni al DNA indotti da PM2,5nei cuori sezionati degli embrioni di zebrafish.
Abstract
L'esposizione al particolato fine ambientale (PM2,5)può portare a tossicità per lo sviluppo cardiaco, ma i meccanismi molecolari sottostanti non sono ancora chiari. L'8-idrossi-2'deossigenasi (8-OHdG) è un marker del danno ossidativo al DNA e γH2AX è un marcatore sensibile per le rotture del doppio filamento del DNA. In questo studio, abbiamo mirato a rilevare i cambiamenti 8-OHdG eγH2AXindotti da PM 2,5 nel cuore degli embrioni di zebrafish utilizzando un test di immunofluorescenza. Gli embrioni di zebrafish sono stati trattati con sostanze organiche estraibili (EOM) da PM2,5 a 5 μg/mL in presenza o assenza di N-acetil-L-cisteina antiossidante (NAC, 0,25 μM) a 2 ore dopo la fecondazione (hpf). DMSO è stato utilizzato come controllo del veicolo. A 72 hpf, i cuori sono stati sezionati dagli embrioni usando un ago a siringa e fissati e permeabilizzati. Dopo essere stati bloccati, i campioni sono stati sondati con anticorpi primari contro 8-OHdG e γH2AX. I campioni sono stati poi lavati e incubati con anticorpi secondari. Le immagini risultanti sono state osservate al microscopio a fluorescenza e quantificate utilizzando ImageJ. I risultati mostrano che EOM da PM2.5 ha migliorato significativamente i segnali 8-OHdG e γH2AX nel cuore degli embrioni di zebrafish. Tuttavia, NAC, agendo come spazzino di specie reattive dell'ossigeno (ROS), ha parzialmente contrastato il danno al DNA indotto dall'EOM. Qui, presentiamo un protocollo di immunofluorescenza per studiare il ruolo del danno al DNA nei difetti cardiaci indotti da PM2,5che possono essere applicati al rilevamento di cambiamenti di espressione proteica indotti da sostanze chimiche ambientali nei cuori degli embrioni di zebrafish.
Introduction
L'inquinamento atmosferico è ora un grave problema ambientale che il mondo deve affrontare. Il particolato fine ambientale (PM2,5), che è uno degli indicatori più importanti della qualità dell'aria, può trasportare un gran numero di sostanze nocive ed entrare nel sistema circolatorio del sangue, causando gravi danni alla salute umana1. Studi epidemiologici hanno dimostrato che l'esposizione al PM2,5 può portare ad un aumento del rischio di difetti cardiaci congeniti (CHD)2,3. Le prove degli esperimenti sugli animali hanno anche dimostrato che il PM2,5 può causare uno sviluppo cardiaco anormale negli embrioni di zebrafish e nella prole dei topi, ma i meccanismi molecolari della tossicità dello sviluppo cardiaco del PM2,5 sono ancora in gran parte sconosciuti4,5,6.
Il danno al DNA può causare l'arresto del ciclo cellulare e indurre l'apoptosi, che può distruggere ampiamente il potenziale delle cellule progenitrici e, di conseguenza, compromettere lo sviluppo del cuore7). È stato ben documentato che gli inquinanti ambientali, tra cui il PM2,5,hanno il potenziale di attaccare il DNA attraverso meccanismi di stress ossidativo8,9. Sia lo sviluppo cardiaco umano che quello del pesce zebra sono sensibili allo stress ossidativo10,11,12. 8-OHdG è un marcatore di danno ossidativo del DNA e il segnale γH2AX è un marcatore di rotture del doppio filamento di DNA. N-acetil-L-cisteina (NAC), un precursore sintetico della cisteina intracellulare e del glutatione, è ampiamente usato come composto antiossidante. In questo studio, utilizziamo NAC per indagare il ruolo dello stress ossidativo in PM2.5- danno al DNA indotto13.
Zebrafish come vertebrato modello è stato ampiamente utilizzato per studiare lo sviluppo cardiaco e le malattie cardiovascolari umane perché i meccanismi di sviluppo cardiaco sono altamente conservati tra i vertebrati14,15. I vantaggi dell'utilizzo del pesce zebra come modello includono le loro piccole dimensioni, la forte capacità riproduttiva e il basso costo di alimentazione. Di particolare interesse per questi studi, gli embrioni di zebrafish non dipendono dal sistema circolatorio durante lo sviluppo precoce e possono sopravvivere a gravi malformazioni cardiache14. Inoltre, la loro trasparenza consente di osservare direttamente l'intero corpo al microscopio. Pertanto, gli embrioni di zebrafish offrono un'eccezionale opportunità per valutare i meccanismi molecolari coinvolti nell'induzione della tossicità dello sviluppo cardiaco a seguito dell'esposizione a varie sostanze chimiche ambientali5,16,17. Abbiamo precedentemente riferito che lo stress ossidativo indotto da PM2,5porta a danni al DNA e apoptosi, con conseguenti malformazioni cardiache nel pesce zebra18. In questo studio, forniamo un protocollo dettagliato per indagare il danno al DNA indotto da PM2,5nel cuore degli embrioni di zebrafish.
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Protocol
Il pesce zebra selvatico (AB) utilizzato in questo studio è stato ottenuto dal National Zebrafish Resource Center di Wuhan, in Cina. Tutte le procedure per gli animali qui descritte sono state riviste e approvate dall'Animal Care Institution del Comitato Etico della Soochow University.
1. Campionamento PM2.5 ed estrazione di composti organici
NOTA: PM2.5 è stato raccolto in un'area urbana a Suzhou, Cina, 1-7 agosto 2015, come descritto in precedenza5.
- Cuocere filtri a membrana di quarzo da 47 mm in un forno a muffola a 500 °C per 2 ore per rimuovere i componenti organici.
- Posizionare un filtro in un campionatore PM2.5 per 24 ore di campionamento ininterrotto.
- Rimuovere il filtro e asciugare per 24 ore a temperatura ambiente.
- Quantificare il filtro con una bilancia analitica.
- Estrarre i componenti organici dal filtro mediante estrazione Soxhlet utilizzando il diclorometano come solvente19.
- Asciugare l'EOM mediante evaporazione rotativa in un bagno d'acqua a 60 °C e flusso di azoto. Sciogliere EOM in DMSO e conservare a -20 °C.
2. Raccolta e trattamento degli embrioni di Zebrafish
- Mantenere il pesce zebra a 28,5 ± 0,5 °C in un sistema di acquacoltura a ricircolamento con un ciclo fotoperiodo di 14 ore di luce e 10 ore di buio.
- Posiziona il pesce zebra adulto sano in un acquario con un rapporto maschio-femmina di 2: 1.
- Il giorno dopo, raccogli gli embrioni e lavali con acqua di sistema (cioè acqua di riproduzione del pesce zebra).
- Selezionare e dividere casualmente gli embrioni di zebrafish che dimostrano uno sviluppo normale (dimensioni uniformi, pieno fiore e nessuna coagulazione delle uova) in 4 gruppi in singole piastre di Petri di vetro con un diametro di 7 cm (circa 50 embrioni per piatto).
- Trattare gli embrioni con PM2,5 (5 mg/L) in presenza o assenza di NAC a 0,25 μM da 2 hpf fino a 72 hpf. Utilizzare DMSO come controllo del veicolo fino a una concentrazione finale allo 0,1% (v/v).
3. Osservazione morfologica degli embrioni di zebrafish e dissezione cardiaca
- A 72 hpf, trasferire gli embrioni su vetrini di vetro e osservare al microscopio stereo. Registrare malformazioni cardiache, come edema pericardico, loop alterato e dimensioni ridotte.
- Calcola i tassi di malformazione (la percentuale di embrioni con difetti cardiaci sul totale degli embrioni viventi) e analizza le differenze tra i gruppi utilizzando ANOVA uninozionale seguito dal test di confronto multiplo della Turchia (p < 0,05 = statisticamente significativo).
- Anestetizzare gli embrioni con 0,6 mg/ml di MS-222 per immobilizzarli su vetrini.
- Registra i battiti cardiaci per 30 s e quantifica la frequenza cardiaca utilizzando il software ImageJ5,20.
- Seziona i cuori degli embrioni di zebrafish con un ago a siringa usa e getta sotto uno stereomicroscopio. Attenzione: evitare di distruggere la forma del cuore.
4. Saggio di immunofluorescenza
- Per utilizzare un test di immunofluorescenza per rilevare danni al DNA indotti da PM2,5 nel cuore degli embrioni di zebrafish, utilizzare una penna barriera idrofoba per disegnare un cerchio su un lato di vetro pulito.
- Aggiungere 50 μL di paraformaldeide al 4% a 1,25 mL di Soluzione Salina Tamponata con Fosfato (PBS) per creare una soluzione fissativa.
- Posizionare 3 cuori sezionati in un cerchio di penna barriera idrofobica e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Decantare la soluzione al microscopio e asciugare i campioni a temperatura ambiente per almeno 5 minuti, in modo che i cuori si attacchino completamente ai vetrini.
- Lavare le diapositive tre volte in PBS con 0,1% Tween 20 (PBST) per 5 minuti per lavaggio.
- Aggiungere 50 μL di albumina sierica bovina (BSA) a 1000 μL di PBST per ottenere una soluzione di BSA al 5% e incubare i vetrini in una camera umida per 1 ora per bloccare il legame anticorpale non specifico.
- Decantare la soluzione e lavare i campioni tre volte con PBST per 5 minuti per lavaggio.
- Diluire 2 μL di anticorpo monoclonale di topo contro 8-OHdG e 2 μL di anticorpo policlonale di coniglio contro γH2AX in 296 μL di PBST per ottenere una soluzione cocktail anticorpale primaria funzionante.
- Incubare i campioni cardiaci con 50 μL della soluzione di cocktail anticorpale primario contro 8-OHdG e γH2AX in una camera umidificata per almeno un'ora a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C (l'incubazione notturna può aumentare l'intensità del segnale).
- Decantare la soluzione e lavare i campioni tre volte con PBST per 5 minuti per lavaggio.
- Diluire 1 μL di anticorpo secondario anti-topo di capra marcato CON FITC e 1 μL di anticorpo secondario anti-coniglio di capra cy3 in 498 μL di PBST per ottenere una soluzione di cocktail di anticorpi secondari funzionanti e incubare i campioni con gli anticorpi secondari (1:500 in PBST) per 1 ora a temperatura ambiente al buio.
- Decantare la soluzione e lavare i campioni tre volte con PBS per 5 minuti per lavaggio al riparo dalla luce.
- Aggiungere 20 μL di DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo) ai campioni per la colorazione nucleare per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Applicare una copertina per scorrere e sigillare con lo smalto per evitare l'asciugatura e il movimento. Quindi immagine i campioni al microscopio a fluorescenza e quantifica il segnale di fluorescenza dell'area cardiaca utilizzando il software ImageJ. Calcola le variazioni relative con la media dei campioni di controllo DMSO. Determinare la significatività statistica dei dati come nel passaggio 3.2.
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Representative Results
Questo test di immunofluorescenza è un metodo sensibile e specifico per misurare i cambiamenti di espressione proteica nei cuori degli embrioni di zebrafish esposti a sostanze chimiche ambientali.
In questa analisi rappresentativa, gli embrioni esposti a PM2,5 in assenza o presenza del NAC antiossidante sono stati valutati per la presenza di malformazioni cardiache (Figura 1). Come osservato, l'EOM da PM2,5 ha causato un aumento significativo della teratogenesi cardiaca, come edema pericardico, loop alterato e diminuzione delle dimensioni, rispetto ai cuori trattati con controllo DMSO. Anche la frequenza cardiaca è diminuita significativamente negli embrioni esposti all'EOM (Figura 1B). L'aggiunta di NAC ha attenuato significativamente i difetti cardiaci indotti da EOM (Figura 1).
Qui il test di immunofluorescenza è stato utilizzato per misurare l'espressione di 8-OHdG e γH2AX nell'embrione di zebrafish per valutare l'entità del danno al DNA nei tessuti trattati con EOM. Come mostrato nella Figura 2,i livelli di espressione di 8-OHdG e γH2AX sono stati significativamente aumentati nei cuori degli embrioni di zebrafish trattati con il gruppo EOM rispetto al controllo, cuori trattati con DMSO, indicando un aumento del danno ossidativo al DNA e delle rotture del doppio filamento del DNA, rispettivamente. Inoltre, il danno al DNA indotto dalle MEO è stato parzialmente contrastato dall'integrazione di NAC (Figura 2).
Figura 1. Difetti cardiaci di embrioni di zebrafish a 72 hpf. (A) Immagini di embrioni di zebrafish a 72 hpf. Le linee tratteggiate indicano atri (rosso) o ventricoli (blu). Barra di scala, 200 μm. (B) Malformazione cardiaca e frequenza cardiaca. I risultati sono presentati come ± SEM. Sono stati esaminati almeno 50 embrioni in ciascun gruppo. EOM: EOM a 5 mg/L; NAC: NAC a 0,25 μM.. **,P < 0,01; , p<0.001 Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Danno al DNA nel cuore degli embrioni di zebrafish a 72 hpf. A) Colorazione a immunofluorescenza. Barra della scala, 100 μm. B) Risultati quantitativi. I risultati sono stati presentati come ± SEM. Sono stati esaminati almeno 15 cuori di ciascun gruppo. EOM: EOM a 5 mg/L; NAC: NAC a 0,25 μM. **; P < 0,01; ***; p<0,001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Sebbene il pesce zebra sia un eccellente modello di vertebrato per studiare la tossicità dello sviluppo cardiaco delle sostanze chimiche ambientali, a causa delle piccole dimensioni del cuore dell'embrione, è difficile ottenere abbastanza proteine per l'analisi western blot. Pertanto, presentiamo un metodo di immunofluorescenza sensibile per quantificare i livelli di espressione proteica dei biomarcatori di danno al DNA nei cuori degli embrioni di zebrafish esposti a PM2.5.
Durante la dissezione, è importante mantenere intatta l'integrità del cuore. Nella nostra esperienza, è relativamente facile eseguire l'isolamento a 72 hpf. Inoltre, il cuore deve essere messo in soluzione di fissazione il prima possibile dopo la raccolta. Un altro passo critico è asciugare i campioni per assicurarsi che i cuori sezionati siano completamente attaccati al vetrino. In caso contrario, i campioni possono essere lavati via dal vetrino durante l'etichettatura.
La doppia colorazione a immunofluorescenza viene eseguita per rilevare sia i segnali 8-OHdG che γH2AX nei cuori isolati. Questo metodo non solo consente di risparmiare manodopera e consente l'uso di una dimensione ridotta del campione, ma facilita anche la co-localizzazione dei due segnali. Sebbene questo metodo basato su anticorpi non sia in grado di rilevare segnali di fluorescenza negli embrioni viventi, questo protocollo rapido può essere utilizzato per rilevare l'espressione proteica in cuori di embrioni di zebrafish isolati.
È stato frequentemente riportato che lo stress ossidativo media il danno al DNA indotto da PM2,58,9. Un'eccessiva produzione di ROS può portare a danni al DNA e apoptosi durante lo sviluppo embrionale del pesce zebra21,22,23. Come abbiamo precedentemente riportato18, un aumento dell'espressione del segnale 8-OHdG e γH2AX è osservato nei cuori degli embrioni di zebrafish esposti a EOM, le cui espressioni sono significativamente contrastate dal trattamento con il ROS scavenger NAC. È interessante notare che il NAC non inverte completamente l'espressione del segnale di danno al DNA indotto da PM2,5,indicando che lo stress ossidativo può contribuire solo parzialmente al danno al DNA osservato nei cuori degli embrioni di zebrafish esposti a PM2,5.
In conclusione, questo metodo utilizza una tecnica sensibile per rilevare il danno al DNA indotto da PM2,5 nei cuori intatti degli embrioni di zebrafish. Inoltre, il metodo può essere applicato per rilevare i cambiamenti di espressione proteica nei cuori degli embrioni di zebrafish esposti ad altre sostanze chimiche ambientali.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Nature Sciences Foundation of China (numero di sovvenzione: 81870239, 81741005, 81972999) e the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-OHdG Antibody | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Primary antibody |
| Analytical balance | Sartorius,China | BSA124S | |
| BSA | Solarbio,Beijing,China | SW3015 | For blocking |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | For nuclear counterstain. |
| DMSO | Solarbio,Beijing,China | D8371 | |
| Fluorescence microscope | Olympus, Japan | IX73 | For imaging fluorescence signals/ |
| Goat Anti-Rabbit IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Secondary antibody |
| Goat Anti-Rabbit IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Secondary antibody |
| N-Acetyl-L-cysteine(NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, China | 616-91-1 | |
| Orbital shaker | QILINBEIER,China | TS-1 | |
| Paraformaldehyde | Sigma,China | P6148 | Make 4% paraformaldehyde for fixation. |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone,USA | SH30256.01 | Prepare 0.1% Tween in PBS for washing. |
| PM2.5 sampler | TianHong,Wuhan, China | TH-150C | For 24-hr uninterrupted PM2.5 sampling. |
| Re-circulating aquaculture system | HaiSheng,Shanghai,China | The zebrafish was maintained in it. | |
| Soxhlet extractor | ZhengQiao,Shanghai, China | BSXT-02 | For organic components extraction. |
| Stereomicroscope | Nikon,Canada | SMZ645 | For heart dissection from zebrafish embryos. |
| Tricaine methanesulfonate (MS222) | Sigma,China | E10521 | To anesthetize zebrafish embryos |
| Tween 20 | Sigma,China | P1379 | |
| γH2AX Antibody | Abcam, USA | ab26350 | Primary antibody |
References
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