Summary
Den presenterte metoden muliggjør visualisering av fluorescerende merkede cellulære proteiner med ekspansjonsmikroskopi som fører til en oppløsning på 70 nm på et konvensjonelt mikroskop.
Abstract
Forstyrrelse av det glomerulære filteret som består av det glomerulære endotelet, glomerulær kjellermembran og podocytter, resulterer i albuminuri. Podocyttfotprosesser inneholder aktinbunter som binder seg til cytoskeletale adapterproteiner som podocin. Disse adapterproteinene, som podocin, forbinder ryggraden i den glomerulære slitmembranen, som nephrin, til aktin cytoskjelettet. Å studere lokalisering og funksjon av disse og andre podocytiske proteiner er avgjørende for forståelsen av det glomerulære filterets rolle i helse og sykdom. Den presenterte protokollen gjør det mulig for brukeren å visualisere aktin, podocin og nephrin i celler med superoppløsningsavbildning på et konvensjonelt mikroskop. For det første er celler farget med en konvensjonell immunfluorescensteknikk. Alle proteiner i prøven er deretter kovalent forankret til en hovne hydrogel. Gjennom fordøyelsen med proteinase K er strukturelle proteiner spaltet slik at isotropisk hevelse i gelen i siste trinn. Dialyse av prøven i vann resulterer i en 4-4,5 ganger utvidelse av prøven, og prøven kan avbildes via et konvensjonelt fluorescensmikroskop, noe som gir en potensiell oppløsning på 70 nm.
Introduction
Albuminuria er en surrogatparameter for kardiovaskulær risiko og skyldes forstyrrelser i det glomerulære filteret1. Det glomerulære filteret består av det fenesterte endotelet, den glomerulære kjellermembranen og den spaltede membranen dannet av podocytter. Primære og sekundære fotprosesser av podocytter vikles rundt kapillærveggen til glomerulum2. Den delikate strukturen av fotprosesser opprettholdes av kortikale aktinbunter som også tjener som ankre for flere spaltemembranproteiner og andre adapterproteiner2. Den slit membranens ryggradsprotein kalles nephrin og samhandler på en homofil måte med nephrinmolekyler av motsatte podocytter. Via forskjellige adapterproteiner er nephrin knyttet til aktin cytoskeleton2,3. Mutasjoner i nephrinkodingsgenet NPHS1 fører til nefrotisk syndrom av finsk type4.
Et av Nephrins interagerende proteiner er podocin, et hårnållignende protein i stomatinfamilien3. Podocin rekrutterer nephrin til lipidflåter og knytter den til aktin cytoskeleton5. Podocin er kodet av NPHS2-genet. Mutasjoner i NPHS2 fører til steroidresistent nefrotisk syndrom6.
For å visualisere og samlokualisere aktinadapterproteiner, kan immunfluorescensteknikker brukes. Dessverre begrenser lysets diffraksjonsbarriere oppløsningen av konvensjonelle fluorescensmikroskop til 200-350 nm7. Nye mikroskopiteknikker, for eksempel stimulert utslippsuttømming (STED)8, fotoaktivert lokaliseringsmikroskopi (PALM)9, stokastisk optisk rekonstruksjonsmikroskopi (STORM eller dSTORM) eller mikroskopi for sletting av bakketilstand etterfulgt av individuell molekylretur (GSDIM)9,10,11, muliggjør en oppløsning på opptil ca. 10 nm. Imidlertid krever disse superoppløsningsteknikkene svært dyre mikroskoper, godt trent personell og er derfor ikke tilgjengelige i mange laboratorier.
Utvidelsesmikroskopi (ExM) er en ny og enkel teknikk som muliggjør superoppløsningsavbildning med konvensjonelle mikroskoper og er potensielt tilgjengelig for et stort forskningsmiljø12. I proteinretensjon ekspansjon mikroskopi (proExM), er prøven av interesse (celler eller vev) løst og farget med fluoroforer13. Proteiner i prøven er deretter kovalent forankret av et lite molekyl (6-((Acryloyl)amino)heksanosyre, succinimidylstere, AcX) i en hovne hydrogel13. Gjennom enzymatisk fordøyelse med proteinase K (ProK) opprettholder proteiner og fluoroforer sin relative posisjon i gelen etter utvidelse13. Etter hevelse i gelen utvides prøven opptil 4,5 ganger (90 ganger volumetrisk ekspansjon) noe som fører til en effektiv lateral oppløsning på ca. 60-70 nm (300 nm / 4,5). Modifikasjoner av denne teknikken kan til og med tillate en 10 ganger utvidelse (1000 ganger volumetrisk ekspansjon), noe som gir en oppløsning på 20-30 nm på konvensjonelle mikroskoper14,15,16.
Glomerulære strukturer av mus og menneskelige nyrer har blitt visualisert via ExM17. I dette dokumentet presenterer vi en detaljert proExM-protokoll for å visualisere superoppløsningsbilder av F-aktin og actin-adapter protein podocin i celler ved hjelp av et konvensjonelt fluorescensmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Splitting og såing av celler
- Varm opp sterile Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) inkludert 10% føtal kalv serum (FCS), steril fosfat bufret saltvann (PBS) og sterile trypsin til 37 °C. Aktiver den rene benken.
- Forbered en 6-brønns plate ved å legge til en steril glassdekselslipp (10 mm) til hver brønn ved hjelp av sterile tang.
- Sett en 10 cm cellekulturrett med Cos7-celler under den rene benken. Under den rene benken aspirerer du cellenes medium ved hjelp av en vakuumenhet.
- Hold den angulerte cellekulturretten i den ene hånden og tilsett 10 ml steril PBS på siden av cellekulturretten for å unngå å skylle av celler. Legg ned cellekulturretten slik at PBS skyller hele cellekulturretten.
- Fjern PBS og tilsett 1 ml trypsin til midten av cellekulturretten og inkuber i 5 min ved 37 °C.
- Stopp trypsiniseringsreaksjonen ved å legge til 10 ml DMEM inkludert 10% FCS og pipette celleløsningen opp og ned med en pipettor for å skille cellene manuelt.
- Analyser cellenummeret per milliliter ved hjelp av et tellekammer.
- Frø 68.000 celler i 2 ml medium per brønn på glassdekselet glir i 6-brønnsplaten. Fordel cellene i 6-brønnsplaten ved forsiktig å riste platen horisontalt og vertikalt.
MERK: Celler skal ligge spredt. - Inkuber cellene over natten i en 37 °C inkubator med 5 % CO2.
2. Transfeksjon av celler
- Forbered to sterile 1,5 ml rør (ett for fortynnet DNA (A) og ett for fortynnet reagens for kationisk lipidtransfeksjon (B)). Pipette 0,75 μg nephrin og 0,75 μg podocin cDNA-uttrykk plasmid per brønn i ett 1,5 ml rør og fortynn det til 100 μL redusert serummedium per brønn. Tilsett 3 μL kationisk lipidtransfeksjonsreagens per brønn til det andre 1,5 ml røret og fortynn med 100 μL redusert serummedium. Inkuber begge reaksjonene i 5 min ved romtemperatur.
- Kombiner begge reaksjonene (A og B) til et DNA-lipidkompleks og inkuber i 20 minutter ved romtemperatur. Tilsett forsiktig 200 μL av DNA-lipidkomplekset til hver brønn.
- Inkuber de transfekterte cellene ved 37 °C med 5 % CO2 i 48 timer uten å endre mediet.
3. Immunolabeling av cellulære strukturer
- Forbered en festeløsning (4% (w / v) paraformaldehyd i PBS, 1 ml / brønn), permeabiliseringsløsningen (0,5% (w / v) Triton X-100 i PBS, 1 ml / brønn) og en blokkeringsløsning (5% (v / v) bovint serumalbumin i PBS, 1 ml / brønn).
- Fjern mediet med en vakuumenhet. Tilsett 2 ml PBS i hver brønn for å fjerne ekstra middels. Aspirer PBS helt.
MERK: For å unngå å vaske bort celler med PBS, må du passe på at pipette PBS ikke kommer direkte på glassdekselet. - Fest celler med 4% (w / v) paraformaldehyd (PFA) oppløst i PBS i 10 minutter ved romtemperatur.
MERK: Alternativt kan du fikse celler i 3% (v / v) glyoksal-etanol18. - Kast PFA og vask cellene to ganger i PBS (2 ml hver) ved å unngå direkte pipettering på glassdekselslippene. Permeabiliser de faste cellene med Triton X-100 0,5% (w / v) i PBS i 10 minutter ved romtemperatur.
- Fjern permeabiliseringsløsningen og vask to ganger med PBS som angitt i trinn 3.2.
- Blokker cellene ved å legge til 1 ml 5% (v / v) BSA i PBS i 1 time ved romtemperatur. Inkuber cellene med 200 μL av det primære antistoffet (anti-podocin antistoff 1:200 i 1% (v / v) BSA i PBS) over natten ved 4 °C.
MERK: Alternativt kan du inkubere det primære antistoffet i 1 time ved romtemperatur. - Fjern det primære antistoffet og vask tre ganger med PBS som i trinn 3.2. Tilsett det sekundære antistoffet (geit anti-kanin Alexa 488 1:1000 i 1% (v / v) BSA i PBS) i 1 time ved romtemperatur. Hold cellene i mørket ved hjelp av en boks.
- Kast det sekundære antistoffet og vask med PBS tre ganger.
- Fjern PBS og inkuber cellene med 200 μL anti-nephrin antistoff 1:100 i 1% (v / v) BSA i PBS i 1 time ved romtemperatur. Vask med PBS tre ganger. Hold cellene i mørket ved hjelp av en boks.
- Fjern PBS og inkuber med det sekundære antistoffet esel anti-marsvin 633, 1:200, i 1 time ved romtemperatur. Vask med PBS tre ganger. Hold cellene i mørket ved hjelp av en boks.
4. Utvidelse av mikroskopi
- Forberedelse
- For å danne avstandsstykkene til gelasjonskammeret, kutt glassdekselslippene #1,0 og #1,5 i 5 mm striper (fire hver per glasssklie) ved hjelp av en diamantkniv. Plasser de #1,5 mm dekselglidestripene slik at de danner en firkant på 2,5 cm lengde på en glasssklie og plasser dem i et fargekammer (Figur 2A1-C1). Pipette en dråpe ddH2O inn i hjørnene på firkanten for å feste glassdekselets glidestriper til hverandre og til glasssklie (Figur 2A2-C2).
MERK: Unngå fullstendig tørking av ddH2O da vedheftskraften vil gå tapt. Ved behov, påfør flere dråper ddH2O. Vent i ca. 20 min slik at #1,5 mm dekselslipper er stabilt festet før du starter med trinn 4.1.2. - Plasser fire #1,0 skyvestriper per deksel på #1,5 mm dekselslipper. Fest stripene ved å pipettere en dråpe på hver #1,5 mm dekselglidestripe (Figur 2A3-C3).
MERK: Gelens tykkelse bør være minst 0,15 mm for å lette håndteringen i fremdriften av protokollen. Men for å unngå overdreven gel på toppen av cellene, hold avstandsstykkene høyde nær cellesubstratet. Ved å bruke #1,5 og #1,0 dekselglide striper som avstandsstykker, vil avstandsstykkehøyden være ca. 0,3 mm. Cellene holder seg til dekkglasset (høyde 0, 12 mm). Derfor vil gelen være tykk nok til å håndtere, men overdreven gel på toppen av cellene unngås ved hjelp av #1,0 og #1,5 dekselglassstriper som avstandsstykker. - For gelasjonskammerlokket, pakk et dekselglass (#1,5) med parafinfilm. Unngå folder eller smuss på parafinfilmen (Figur 2A5-C5).
- For å danne avstandsstykkene til gelasjonskammeret, kutt glassdekselslippene #1,0 og #1,5 i 5 mm striper (fire hver per glasssklie) ved hjelp av en diamantkniv. Plasser de #1,5 mm dekselglidestripene slik at de danner en firkant på 2,5 cm lengde på en glasssklie og plasser dem i et fargekammer (Figur 2A1-C1). Pipette en dråpe ddH2O inn i hjørnene på firkanten for å feste glassdekselets glidestriper til hverandre og til glasssklie (Figur 2A2-C2).
- Forankring og polymerisering (gelering)
- Klargjør forankringsbufferen (se tabell 1). For forankringsbehandling, erstatt PBS med 250 μL forankringsbuffer per brønn direkte på glassdekselglidning og inkuber i 3 timer ved romtemperatur. Hold substratet i mørket ved hjelp av en boks.
MERK: Alternativt kan du inkubere over natten ved romtemperatur. Forbered fersk forankringsbuffer for hvert eksperiment og vent i 10-15 min til den er oppløst riktig. 6-((Acryloyl)amino)heksanosyre, succinimidylstere (AcX) bør byttes hver 4-5 måned for å sikre tilstrekkelig forankring. - Fjern forankringsbufferen og vask én gang med 1,5 ml PBS per brønn.
- For å flekke aktinfibre, tine en ExM-kompatibel falloidinløsning og inkubere falloidinet (5 μL falloidin fortynnet i 195 μL av 1% (v / v) BSA i PBS / brønn) i 45 minutter ved romtemperatur. Hold prøvene i mørket ved hjelp av en boks.
- I mellomtiden oppløses natriumakrylat i ddH2O ved hjelp av en røreenhet. På is, klargjør monomerløsningen (se tabell 1).
MERK: Oppløst natriumakrylat bør være en klar og fargeløs oppløsning. Hvis oppløsningen er gul, erstatt med ny natriumakrylat. - Klargjør geleløsningen på is (se tabell 1). Pipette ammoniumperoksulfat (APS) i gellingoppløsningen rett før geleringsoppløsningen påføres gelasjonskammeret.
- Fjern falloidin fra cellene og vask med 1,5 ml PBS to ganger ved romtemperatur. La 1,5 ml PBS ligge i brønnen for å lette fjerningen av prøven på glassdekselslippet.
- Plasser cellene på dekkglasset i gelekammeret ved hjelp av tang og en kanyle for å løfte dekselglassslippet fra 6-brønnsplaten.
MERK: Cellene skal være på toppen av glassdekselslippet. Glassdekselslippet skal ikke berøre avstandsstykkene. - Legg APS til geleringsløsningen og virvelen om kort tid. Pipette 200 μL geleoppløsning på prøven (Figur 2A4-C4). Lukk gelasjonskammeret forsiktig ved å unngå luftbobler i gelen (Figur 2A5-C5).
- Inkuber gelekammeret i minst 1 time ved 37 °C for å polymerisere gelen i det våte fargingskammeret.
- Klargjør forankringsbufferen (se tabell 1). For forankringsbehandling, erstatt PBS med 250 μL forankringsbuffer per brønn direkte på glassdekselglidning og inkuber i 3 timer ved romtemperatur. Hold substratet i mørket ved hjelp av en boks.
- Homogenisering (fordøyelse)
- Ta fargekammeret ut av inkubatoren. For å åpne gelasjonskammerlokket, innfør et barberblad mellom lokket og avstandsstykket. Fjern lokket forsiktig. Fjern avstandsstykkene med barberbladet og eliminer all ekstra gel ved å kutte den med barberbladet.
- Sett lysbildet med gelen og dekk glasset i en tallerken fylt med PBS. Ved å riste forsiktig, fjern det frittliggende dekkglasset fra gelen. For å fjerne gelen fra parabolen enkelt, legg gliden under gelen for å feste gelen til lysbildet.
- Med gelen på lysbildet, del gelen i små biter (kvart av gelen er delt inn i to til tre stykker) ved hjelp av barberbladet. Skyv forsiktig ett stykke gel inn i en brønn på en 6-brønns plate med glassbunn og brett den med en pensel. Hold gelen fuktet med litt MENGDE PBS ved hjelp av penselen for å unngå dehydrering av gelen.
MERK: Cellene vender nedover. - Bruk et invertert mikroskop til å ta oversiktsbilder med lav numerisk blenderåpning for å bestemme ekspansjonsfaktoren etter utvidelse.
- Klargjør fordøyelsesbufferen (se tabell 1). Fortynn Proteinase K til 4 U/ml i fordøyelsesbufferen for å motta fordøyelsesløsningen.
MERK: Fordøyelsesbuffer uten Proteinase K kan oppbevares ved 4 °C i 1-2 uker. - Tilsett 500 μL av fordøyelsesoppløsningen til hver brønn og senk gelen i løsningen. La det fordøye over natten ved romtemperatur og lukk lokket og hold prøvene i mørket.
MERK: Alternativt, la den fordøye ved 37 °C i 1 time.
- Utvidelse
- Fjern fordøyelsesoppløsningen med en pipette og kast den. Tilsett 1 ml ddH2O. Inkuber den nedsenkede gelen i 10 min ved romtemperatur.
- Fjern vannet og tilsett 1 ml fersk ddH2O. Vent i 10 min og fortsett å bytte vann hvert 10.
MERK: Prøveutvidelse opp til 4,5 ganger er oppnåelig. Gelen blir optisk klar.
- Imaging
- Fjern vannet fra gelen og start mikroskopi direkte. Bruk et invertert mikroskop, først og fremst bruke et luftmål (lav forstørrelse) for å finne avbildede celler i førutvidelsestilstanden (trinn 4.3.4).
- Bytt til en 40x (olje / vann) og 63x mål for bedre oppløsning. Begeistre med bølgelengden av interesse og ta bildet via kameraet.
- Validering
- Ta et oversiktsbilde av eksemplet. Finn og samsvarer med de samme strukturene i eksemplet som ble avbildet i trinn 4.3.4. Bruk kanalen med det beste signal-til-støy-forholdet for validering (Figur 3 A-B).
MERK: Juster bildeparameterne for å oppnå lignende lysstyrke som i bildet som er oppnådd i ikke-utvidet tilstand (trinn 4.3.4). - Legg bilder før og etter utvidelse ved å rotere og flytte dem med ImageJ. Bruk avstandsmåleverktøyet i ImageJ til å måle avstandene mellom klart identifiserbare strukturer. Mål minst 10 forskjellige strukturer.
MERK: Alternativt kan du bruke et Python-skript til å måle avstander som beskrevet i14. - Beregn ekspansjonsfaktoren ved å dele målinger etter/forhåndsutvidelse.
- Hvis du vil finne forvrengninger, tar du bilder med en høyere numerisk blenderåpning (Figur 4A-B). Legg disse bildene over og analyser dem med ImageJ eller som beskrevet i15.
MERK: Bestemmelse av forvrengninger bør utføres rutinemessig, men ikke nødvendigvis på hver prøve.
- Ta et oversiktsbilde av eksemplet. Finn og samsvarer med de samme strukturene i eksemplet som ble avbildet i trinn 4.3.4. Bruk kanalen med det beste signal-til-støy-forholdet for validering (Figur 3 A-B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konseptet og tidspunktet for denne proExM-protokollen er avbildet i figur 1. På dag 5 blir transfekterte celler festet og farget med fluorescerende antistoffer rettet mot proteinet av interesse (Figur 1A,B). På dag 6 fører behandling med AcX til dannelse av amingrupper på alle proteiner (inkludert fluoroforer) (Figur 1A,B)12. Ved polymerisering av hydrogelen binder disse amingruppene kovalent til hydrogelen (dag 6). Etter polymerisering av gelen utføres homogenisering (fordøyelse) med proteinase K som resulterer i ødeleggelse av strukturelle proteiner i cellen (dag 6, figur 1A,B). Fluorescerende merkede antistoffer forblir for det meste bevart etter fordøyelsen. På grunn av forstyrrelse av strukturelle proteiner resulterer vanndialyse av hydrogelen i isotrop ekspansjon av cellen i hydrogelen på dag 7 (Figur 1A,B). Avbildning av prøven utføres med et konvensjonelt fluorescensmikroskop (figur 1A). Datavalidering for å bestemme utvidelsesfaktoren og utelate forvrengninger bør utføres (Figur 1A).
For å utføre utvidelse av cellen isotropisk er gelasjonstrinnet viktig. Figur 2 viser lateral og toppvisning av et gelasjonskammer. Glassdekselslipper bygger avstandsstykkene til gelasjonskammeret (Figur 2A1-3/C1-3). Dekkglasset med de faste og fargede cellene er plassert med cellene oppover på en glasssklie (Figur 2A4-C4). Lokket på gelasjonskammeret er pakket inn med parafilm og er lukket boblefritt (Figur 2A5-C5).
Denne ExM-protokollen muliggjør utvidelse av opptil fire ganger. For å bestemme utvidelsesfaktoren er det viktig for bildeceller før og etter utvidelse (Figur 3A + B). Utilstrekkelig forankring og homogenisering kan føre til forvrengninger og brudd på celler. Figur 4A + B viser representative eksempler på ødelagte celler i forskjellige forstørrelsesbilder.
Denne metoden kan brukes til å undersøke samlokalisering av F-aktin- og aktinadapterproteiner, for eksempel podocin og nephrin (figur 5). Podocin er avbildet i grønt mens aktin er merket med blått (Figur 5). Nephrin er merket med grønt. Hvite områder indikerer samlokalisering.
Figur 1: Konsept og tidsberegning for denne ExM-protokollen. (A) I kolonnen "protokoll" er hvert trinn i protokollen disponert. (A + B) Etter sådd og transfekterende celler utføres immunfluorescerende merking (Immunolabeling). (A + B) Det lille molekylet AcX (rød prikk) binder seg til alle proteiner og forankrer dem til hydrogelen (Forankring). (A + B) Via polymerisasjon er alle proteiner inkludert fluoroforer kovalent bundet via AcX til hydrogelen (polymerisering). (A + B) Homogenisering fører til fordøyelsen av strukturelle matriseproteiner. (A + B) Ekspansjon oppnås ved dialyse i vann. (A) Imaging og validering av bildebehandling fullfører eksperimentet. (A) Hele protokollen krever 7 dager (kolonne "dag") med mange inkubasjonstrinn (total tid per dag kolonne "total tid"), men faktisk benketid er mye mindre som angitt i den respektive kolonnen "benktid". Endret fra14. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bygge gelasjonskammeret. Sett fra siden (A1) og ovenfra (B1 + C1) på en glasssklie med fire #1,5 dekselstriper. Ved å legge til en dråpe vann mellom glasssklie og dekselglidestriper, vil stripene feste seg til glasssklie (sidevisning A2, sett ovenfra B2, C2). Vanndråper på #1,5 dekselstriper fører til vedheft av #1,0 dekselstriper lagt oppå de #1,5 dekselstriper (sidevisning A3, toppvisning B3, C3). Prøven på dekselslippet er plassert midt på rektangelet ved hjelp av tang. Gelen pipettes på toppen (sidevisning A4, sett ovenfra B4, C4). (A5) Sett fra siden og ovenfra (B5 og C5) på det monterte gelasjonskammeret, inkludert det lukkede lokket som er bygget av en dekselglidning innpakket i parafilm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Celler før og etter utvidelse. (A) Celler før utvidelse farget for aktin. Boksen angir i hvilket område de utvidede cellene i figur 3B ligger. (B) Celler etter ekspansjon farget for aktin i rødt og podocin i grønt. Podocin samlokulerer med aktin i celleperiphery. Skalastang = 5 μm, ekspansjonsfaktor = 2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Forvrengninger og brudd på celler. (A + B) Representative mikroskopiske bilder av cos7-celler immunfarget for aktin (rød). Celler ble fikset, farget, forankret, fordøyd og utvidet. (A) Brudd på celler. Piler indikerte ødelagte områder. Skalastang = 5 μm, ekspansjonsfaktor = 4. (B) Brudd og forvrengning av celler. Hvite piler indikerte ødelagte områder. Skalastang = 5 μm, ekspansjonsfaktor = 4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Podocin samlokatiserer med nephrin og aktin. Cos7 celler immunfluorescently merket for podocin, aktin og nephrin. (A) Cos7 celler farget for podocin (grønn), aktin (blå) og nephrin (rød) med ExM. Podocin samlokiserer med aktin og nephrin. Skalastang = 200 nm, ekspansjonsfaktor = 4. (B) Forstørrelse av det angitte området i (A), Skalastang = 40 nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Forankringsbuffer | endelig konsentrasjon | ||
| NaHCO3 | 150 mM | ||
| Acryloyl-X, SE (acx) | 0,1 mg/ml | ||
| Monomer løsning | Lagerløsning konsentrasjon g/100 ml | mengde (ml) | endelig konsentrasjon (g/100 ml) |
| natrium akrylat | 38 | 2.25 | 8.6 |
| akrylamid | 50 | 0.5 | 2.5 |
| N,N'-Metylenbisacrylamide | 2 | 0.75 | 0.15 |
| natriumklorid | 29.2 | 4 | 11.7 |
| Pbs | 10x | 1 | 1x |
| Vann | 0.75 | ||
| Totalt | 9.4 | ||
| Gelling løsning | Konsentrasjon av lagerløsning | mengde (μl) | endelig konsentrasjon (mg/ml) |
| monomerløsning | Na | 190 | Na |
| Aps | 10% | 4 | 0.1 |
| TEMED | >99 % | 4 | 0.1 |
| Vann | Na | 2 | Na |
| Totalt | 200 | ||
| Fordøyelsesløsning | endelig konsentrasjon | ||
| Tris Cl, pH 8.0 | 1 M | ||
| EDTA pH 8,0 | 0,5 M | ||
| Triton X-100 | 0.005% | ||
| Guanidin HCL | 8 M | ||
| Vann | |||
| proteinase K | 4 U/ml |
Tabell 1: Løsninger for ExM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterte metoden gjør det mulig for undersøkeren å visualisere cellulære proteiner, for eksempel podocin-, nephrin- og cytoskeletalkomponenter, for eksempel F-aktin. Innenfor denne protokollen brukes transfekterte cos7-celler som en modell for å studere interaksjon av slit membranproteiner med F-aktin. Dessverre uttrykker udødelige podocyttcellelinjer ikke tilstrekkelige endogene mengder slit membranproteiner19.
Med denne metoden kan cellulære proteiner visualiseres med nanoskala oppløsning ved hjelp av et konvensjonelt fluorescensmikroskop. De mest kritiske trinnene i protokollen er: 1) tilstrekkelig forankring av proteinamingrupper til hydrogelen med AcX, 2) tilstrekkelig polymerisering av hydrogelen, 3) optimal timing for fordøyelsen og 4) valg av kompatible fluoroforer.
Forankring av cellulære proteiner til hydrogelen er avgjørende for denne metoden for å bevare proteinets posisjon i hydrogelen under ekspansjon. AcX er et lite molekyl som binder seg til amingrupper av proteiner i celler og vev. AcX skaper et karbonkarbon dobbeltbånd med proteiner, noe som muliggjør inkorporering av proteinene i hydrogelen i polymerisasjonstrinnet20. AcX integrerer også antistoffer slik at merking med immunfluorescence antistoffer kan utføres før AcX behandling. Utilstrekkelig forankring kan føre til brudd og forvrengninger av celler. På grunn av modifikasjon av amingrupper ved fikseringer, må man optimalisere fikserings- eller fikseringstidspunktet. I tillegg kan utilstrekkelig lagring eller ikke-optimaliserte forankringsforhold føre til brudd og forvrengninger. Basert på vår erfaring mister AcX sin optimale effekt når den brukes i mer enn 3-4 måneder.
Polymerisering av gelen er temperaturavhengig. Vi anbefaler derfor å holde polymerisasjonsløsningene på is før du pipetter den inn i gelasjonskammeret. I tillegg bør håndteringstiden til geleringstrinnet holdes kort (mindre enn 5 min) for å unngå for tidlig geldannelse. Grundig blanding av polymerisasjonsløsningen forhindrer ujevn polymerisering. Luftbobler vil påvirke ekspansjonsprosessen når du berører prøven og kan forhindres ved å legge til mer polymerisasjonsløsning.
Etter inkorporering av cellulære proteiner i hydrogelen, er det mekaniske homogeniseringstrinnet (eller fordøyelsen) nødvendig for å sikre ekspansjon. Ulike metoder, for eksempel varme og vaskemiddel eller enzymatisk fordøyelse, eksisterer og må tilpasses den undersøkte prøven12,14,20. Innenfor denne protokollen brukes protease Proteinase K til enzymatisk fordøyelse. Proteinase K påføres i en dose som er tilstrekkelig til å ødelegge strukturelle proteiner, samtidig som de fleste andre proteiner, inkludert fluorescerende antistoffer12, bevares. Hvis fordøyelsen er ufullstendig, er prøveutvidelsen utilstrekkelig. I tillegg kan prøven rive under ekspansjonsprosessen (figur 3). Hvis det har oppstått en utilstrekkelig prøveutvidelse, anbefales vannutskifting. Alternativt kan tiden for den enzymatiske fordøyelsen justeres eller en ny aliquot av Proteinase K åpnes.
Hvis prøven er overfordøyd, vil fluorescenssignalene bli redusert. I dette tilfellet bør fordøyelsestiden reduseres. Generelt reduseres fluorescenssignalintensiteten per volumenhet på grunn av den volumetriske utvidelsen avprøven 14. Derfor må lengre eksponeringstider under avbildning vurderes.
Det er viktig å velge ExM-kompatible fluoroforer. Cyaninfargestoffer forringes under polymerisasjonen trinn13. Fluorescensproteiner basert på bakteriofytokromer blir også i stor grad ødelagt13. Imidlertid vil de fleste GFP-lignende proteiner bli bevart13. I tillegg kan streptavidin også brukes før utvidelse, merking etter oversettelsesendringer som S-nitrolysasjon via en litenmolekylkode 13.
Phalloidin, et lite merkemolekyl for å målrette actin cytoskeleton, er ikke kompatibel med ExM21. For å overvinne utilstrekkelig forankring av falloidin, har trivalent forankring (TRITON) blitt introdusert21. Denne tilnærmingen tilbyr samtidig målretting, merking og podning av biomolekyler21.
Denne metoden kan modifiseres for å flekke RNA-molekyler (ExFish)22. Ved iterativ ekspansjonsmikroskopi (iExM) eller X10-mikroskopi kan oppløsningen på 60-70 nm forlenges til ca. 25 nm ved å påføre en annen flott gel i den første utvidede hydrogelen eller gjennomføre et enkelt ekspansjonstrinn ved hjelp av en annen hydrogel15,16. Ultrastrukturell ekspansjonsmikroskopi (U-ExM) muliggjør overoppløsning av proteiner som bevarer attribusjonen til et ultrastrukturelt element (f.eks. mitokykronria, mikrotubuler)23. En kombinasjon av ExFish (RNA og DNA) og proExM metoder har tidligere blitt utført samt22,24. Den presenterte protokollen bruker transfekterte cos7-celler som modell for å undersøke slit membranproteiner. Vi forventer at andre bosatte dyrkede nyreceller, for eksempel HEK293T-celler, kan brukes på samme måte for denne protokollen. Avhengig av cellelinjen kan det være nødvendig å justere for de forskjellige forholdene for dyrking og transfeksjon.
ExM forbedrer oppløsningen av immunfargede prøver ved at ca. 4 ganger når en lateral romlig oppløsning på 70 nm13. Sammenlignet med andre superoppløsningsteknikker utføres ExM på et konvensjonelt fluorescensmikroskop13,14. Derfor er det ikke nødvendig med dyrt utstyr eller spesielt opplært personell for å utføre ExM-metoden14. Selv om ikke alle fluoroforer er kompatible med ExM, er det generelt mange tilgjengelige antistoffer med optimaliserte fluoroforer med foto-fysiske egenskaper som trengs for superoppløsningsmikroskopi14. Den største ulempen ved denne metoden er at ExM ikke er kompatibel med levende prøver12,14.
I fremtiden kan forbedring av hydrogelens kjemiske sammensetning føre til enda høyere romlig oppløsning12. Kombinasjonen av forskjellige protokoller kan også muliggjøre visualisering av proteiner, RNA, DNA eller lipider i komplekser i samme prøve med så høy oppløsning12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Blanka Duvnjak og Nikola Kuhr for deres utmerkede tekniske assistanse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide >99% | Sigma-Aldrich | A3553-100G | |
| 6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE | invitrogen | A-20770 | store up to 4 months |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Deckgläser (cover glasses) | Engelbrecht | K12432 | 24x32mm #1.0 |
| Diamont cutter | VWR | 201-0392 | for cutting the cover slips |
| Guanidine HCl | Sigma-Aldrich | G3272-100G | 8M Stock can be kept at RT |
| Marten hair paintbrush | Leon Hardy | 3 (770) | |
| "Menzel" Deckgläser (cover glasses) | Thermo Fischer | 15654786 | 24x24mm #1.5 |
| N,N`-Methylenbisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7256-25G | |
| Objektträger UniMark | Marienfeld | 703010 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium Acrylate | Sigma-Aldrich | 408220 | check purity |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Staining chamber | produced at the university's workshop | ||
| TEMED | ROTH | 2367.1 | |
| 6-Well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Antibodies | |||
| Actin-ExM 546 | chrometra | non-available | 1:40 |
| Anti Podocin produced in rabbit | Sigma | P-0372-200UL | 1:200 |
| Donkey anti guinea-pig CF633 | Sigma | SAB4600129-50UL | 1:200 |
| Goat anti rabbit 488 | Life Technologies | A11034 | 1:1000 |
| Guinea pig anti nephrin | Origene | BP5030 | 1:100 |
| Software | |||
| FIJI | |||
| Visiview | |||
| microscope | |||
| AXIO Observer Z1 | Zeiss | non-available |
References
- Matsushita, K., et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).
- Saleem, M. A., et al. Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton - Evidence for a role in podocyte foot process formation. American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein - nephrin - is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Huber, T. B., et al. Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8 (2003).
- Boute, N., et al. NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome. Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Testa, I., et al. Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength. Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).
- Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. Embo Reports. 19 (9), (2018).
- Chang, J. B., et al.
- Chozinski, T. J., et al. nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10396 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Rinschen, M. M., et al. Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).
- Asano, S. M., et al. Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
