Hi-C en el núcleo en células de Drosophila
Summary
El genoma está organizado en el espacio nuclear en diferentes estructuras que pueden revelarse a través de tecnologías de captura de conformación cromosómica. El método Hi-C en el núcleo proporciona una colección de interacciones de cromatina en líneas celulares de Drosophila en todo el genoma, que genera mapas de contacto que se pueden explorar a resolución de megabase a nivel de fragmento de restricción.
Abstract
El genoma está organizado en dominios topológicamente asociativos (TADs) delimitados por límites que aíslan las interacciones entre dominios. En Drosophila, los mecanismos subyacentes a la formación y los límites de TAD aún están bajo investigación. La aplicación del método Hi-C en el núcleo descrito aquí ayudó a diseccionar la función de los sitios de unión a proteínas arquitectónicas (AP) en los límites de TAD aislando el gen Notch. La modificación genética de los límites del dominio que causan la pérdida de AP da como resultado la fusión de TAD, defectos transcripcionales y alteraciones topológicas de largo alcance. Estos resultados proporcionaron evidencia que demuestra la contribución de los elementos genéticos a la formación de límites de dominio y al control de la expresión génica en Drosophila. Aquí, se ha descrito en detalle el método Hi-C en el núcleo, que proporciona puntos de control importantes para evaluar la calidad del experimento junto con el protocolo. También se muestran los números requeridos de lecturas de secuenciación y pares Hi-C válidos para analizar las interacciones genómicas a diferentes escalas genómicas. La edición genética mediada por CRISPR/Cas9 de elementos reguladores y el perfil de alta resolución de las interacciones genómicas utilizando este protocolo Hi-C en el núcleo podrían ser una combinación poderosa para la investigación de la función estructural de los elementos genéticos.
Introduction
En los eucariotas, el genoma se divide en cromosomas que ocupan territorios específicos en el espacio nuclear durante la interfase1. La cromatina que forma los cromosomas se puede dividir en dos estados principales: uno de cromatina accesible que es transcripcionalmente permisiva, y el otro de cromatina compacta que es transcripcionalmente represiva. Estos estados de cromatina segregan y rara vez se mezclan en el espacio nuclear, formando dos compartimentos distintos en el núcleo2. En la escala sub-megabase, los límites separan los dominios de las interacciones de cromatina de alta frecuencia, llamadas TADs, que marcan la organización cromosómica3,4,5. En los mamíferos, los límites tad están ocupados por la cohesina y el factor de unión a CCCTC (CTCF)6,7,8. El complejo de cohesina extruye la cromatina y se detiene en los sitios de unión a CTCF que se disponen en una orientación convergente en la secuencia genómica para formar bucles de cromatina estables9,10,13,14. La alteración genética del sitio de unión al ADN de CTCF en los límites o la reducción de la abundancia de CTCF y proteína de cohesina da como resultado interacciones anormales entre los elementos reguladores, la pérdida de la formación de TAD y la desregulación de la expresión génica9,10,11,13,14.
En Drosophila, los límites entre los TADs están ocupados por varios AP, incluyendo el factor asociado al elemento límite 32 kDa (BEAF-32), la proteína de unión al Motivo 1 (M1BP), la proteína centrosómica 190 (CP190), el supresor del ala peluda (SuHW) y el CTCF, y están enriquecidos en modificaciones activas de histonas y polimerasa II16,17,18. Se ha sugerido que en Drosophila, los TADs aparecen como consecuencia de la transcripción13, 17,19,y el papel exacto de los AP independientes en la formación de límites y las propiedades de aislamiento aún está bajo investigación. Por lo tanto, queda por caracterizar completamente si los dominios en Drosophila son una consecuencia exclusiva de la agregación de regiones de estados transcripcionales similares o si los AP, incluido el CTCF, contribuyen a la formación de límites. La exploración de contactos genómicos a alta resolución ha sido posible a través del desarrollo de tecnologías de captura de conformación cromosómica junto con la secuenciación de próxima generación. El protocolo Hi-C se describió por primera vez con la etapa de ligadura realizada “en solución”2 en un intento de evitar productos de ligadura espurios entre fragmentos de cromatina. Sin embargo, varios estudios apuntaron a la comprensión de que la señal útil en los datos provenía de productos de ligadura formados en núcleos parcialmente lisados que no estaban en la solución20,21.
El protocolo se modificó para realizar la ligadura dentro del núcleo como parte del experimento Hi-C unicelular22. El protocolo Hi-C en el núcleo se incorporó posteriormente a la población celular Hi-C para producir una cobertura más consistente en todo el rango de distancias genómicas y producir datos con menos ruido técnico23,24. El protocolo, descrito en detalle aquí, se basa en el protocolo Hi-C de la población en el núcleo23,24 y se utilizó para investigar las consecuencias de eliminar genéticamente los motivos de unión al ADN para CTCF y M1BP de un límite de dominio en el locus del gen Notch en Drosophila25. Los resultados muestran que la alteración de los motivos de unión al ADN para los AP en el límite tiene consecuencias drásticas para la formación del dominio Notch, defectos topológicos más grandes en las regiones que rodean el locus Notch y la desregulación de la expresión génica. Esto indica que los elementos genéticos en los límites del dominio son importantes para el mantenimiento de la topología del genoma y la expresión génica en Drosophila25.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método Hi-C en núcleo que aquí se presenta ha permitido una exploración detallada de la topología del genoma de Drosophila a alta resolución, proporcionando una visión de las interacciones genómicas a diferentes escalas genómicas, desde bucles de cromatina entre elementos reguladores como promotores y potenciadores hasta TADs e identificación de grandes compartimentos25. La misma tecnología también se ha aplicado eficientemente a los tejidos de mamíferos con algunas modificaciones<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la subvención número IN207319 del Programa de Apoyo a la Innovación Tecnológica y la Investigación (PAPIIT) de la UNAM y la beca número 303068 del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-FORDECyT). A.E.-L. es un estudiante de maestría apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) CVU número 968128.
Materials
| 16% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Agar Scientific | R1026 | |
| Biotin-14-dATP | Invitrogen | CA1524-016 | |
| ClaI enzyme | NEB | R0197S | |
| COVARIS Ultrasonicator | Covaris | LE220-M220 | |
| Cut Smart | NEB | B72002S | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
| Dynabeads MyOne Streptabidin C1 | Invitrogen | 65002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) sterile filtered | Sigma | F9665 | |
| Klenow Dna PolI large fragment | NEB | M0210L | |
| Klenow exo(-) | NEB | M0210S | |
| Ligation Buffer | NEB | B020S | |
| MboI enzyme | NEB | R0147M | |
| NP40-Igepal | SIGMA | CA-420 | Non-ionic surfactant for addition in lysis buffer |
| PE adapter 1.0 | Illumina | 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3' |
|
| PE adapter 2.0 | Illumina | 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 1.0 | Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3' |
|
| PE PCR primer 2.0 | Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3' |
|
| Phenol: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1 | SIGMA | P2069 | |
| Primer 1 (known interaction, Figure 2A) | Sigma | 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3' | |
| Primer 2 (known interactions, Figure 2A) | Sigma | 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3' | |
| Protease inhibitor cocktail tablet | Roche | 4693132001 | |
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| Qubit | ThermoFisher | Q33327 | |
| RNAse | Roche | 10109142001 | |
| SPRI Beads | Beckman | B23318 | |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224-025 | |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase (PNK) | NEB | M0201L | |
| TaqPhusion | NEB | M0530S | DNA polymerase |
| Triton X-100 | Non-ionic surfactant for quenching of SDS |
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