Summary

Celfractionering van U937-cellen door isopycnic density gradient purification

Published: August 12, 2021
doi:

Summary

Dit fractioneringsprotocol stelt onderzoekers in staat om cytoplasmatische, nucleaire, mitochondriale en membraaneiwitten uit zoogdiercellen te isoleren. De laatste twee subcellulaire fracties worden verder gezuiverd via isopycnic dichtheidsgradiënt.

Abstract

Dit protocol beschrijft een methode om subcellulaire eiwitfracties uit zoogdiercellen te verkrijgen met behulp van een combinatie van detergentia, mechanische lysis en isopycnic density gradient centrifugation. Het grote voordeel van deze procedure is dat het niet afhankelijk is van het enige gebruik van oplosbare reinigingsmiddelen om subcellulaire fracties te verkrijgen. Dit maakt het mogelijk om het plasmamembraan te scheiden van andere membraangebonden organellen van de cel. Deze procedure zal de bepaling van eiwitlokalisatie in cellen vergemakkelijken met een reproduceerbare, schaalbare en selectieve methode. Deze methode is met succes gebruikt om cytosolische, nucleaire, mitochondriale en plasmamembraaneiwitten te isoleren uit de menselijke monocytencellijn, U937. Hoewel geoptimaliseerd voor deze cellijn, kan deze procedure dienen als een geschikt startpunt voor de subcellulaire fractionering van andere cellijnen. Mogelijke valkuilen van de procedure en hoe ze te vermijden worden besproken, evenals veranderingen die mogelijk moeten worden overwogen voor andere cellijnen.

Introduction

Subcellulaire fractionering is een procedure waarbij cellen worden gelyseerd en gescheiden in hun samenstellende componenten door middel van verschillende methoden. Deze techniek kan door onderzoekers worden gebruikt om eiwitlokalisatie in zoogdiercellen te bepalen of voor verrijking van eiwitten met een lage abundantie die anders niet detecteerbaar zouden zijn. Hoewel er momenteel methoden voor subcellulaire fractionering bestaan, net als commerciële kits die kunnen worden gekocht, lijden ze aan verschillende beperkingen die deze procedure probeert te overwinnen. De meeste celfractioneringsmethoden zijn uitsluitend op detergent gebaseerd 1,2, afhankelijk van het gebruik van buffers met toenemende hoeveelheden wasmiddel om verschillende cellulaire componenten op te lossen. Hoewel deze methode snel en handig is, resulteert het in onzuivere fracties. Deze zijn ontworpen om onderzoekers in staat te stellen gemakkelijk een of twee componenten van de cel te isoleren, maar zijn niet complex genoeg om meerdere subcellulaire fracties tegelijkertijd uit een monster te isoleren. Alleen vertrouwen op detergentia resulteert meestal in membraan-ingesloten organellen en het plasmamembraan worden willekeurig opgelost, waardoor scheiding van deze componenten moeilijk wordt. Een extra complicatie van het gebruik van deze kits is het onvermogen van onderzoekers om ze te wijzigen / optimaliseren voor specifieke toepassingen, omdat de meeste componenten gepatenteerde formuleringen zijn. Ten slotte kunnen deze kits onbetaalbaar zijn, met beperkingen in het aantal toepassingen waardoor ze minder dan ideaal zijn voor grotere monsters.

Ondanks de beschikbaarheid van kits voor de isolatie van mitochondriën die niet afhankelijk zijn van detergentia, zijn ze niet ontworpen om het plasmamembraan te isoleren en leveren ze aanzienlijk lagere hoeveelheden monster op dan standaard isolatieprotocollen 3,4. Hoewel differentiële centrifugatiemethoden tijdrovender zijn, resulteren ze vaak in verschillende fracties die niet kunnen worden verkregen met uitsluitend op detergenten gebaseerde kits1. Scheiding zonder het enige gebruik van oplosbare reinigingsmiddelen maakt ook verdere zuivering mogelijk met behulp van ultracentrifugatie en isolynische dichtheidsgradiënten, wat resulteert in minder kruisbesmetting. Dit fractioneringsprotocol demonstreert de isolatie van subcellulaire fracties uit U937-monocyten met behulp van een combinatie van op detergentie en hoge snelheid gebaseerde centrifugatiebenaderingen. Deze methode zal de isolatie van de nucleaire, cytoplasmatische, mitochondriale en plasmamembraancomponenten van een zoogdiercel vergemakkelijken met minimale besmetting tussen de fracties.

Protocol

1. Bereid buffers en reagentia voor Bereid verse oplossingen van fosfatase en proteaseremmers.Voeg 17,4 mg fenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) toe aan 1 ml 100% ethanol om een voorraad van 100 mM te bereiden.OPMERKING: Draag beschermende uitrusting bij het hanteren van PMSF, omdat het gevaarlijk is bij inname of inademing en bij contact met huid of ogen. Het is corrosief voor ogen en huid. Volgens de instructies van de fabrikant, bereid een in de handel verkrijgbare proteaseremmer cocktai…

Representative Results

Een schematisch stroomdiagram van deze procedure (figuur 1) geeft een visuele samenvatting van de stappen die zijn genomen om U9375-cellen die in suspensie zijn gekweekt met succes te fractioneren. Fracties verzameld vanaf de bovenkant van de isolycische dichtheidsgradiënt in gelijke volumes (1 ml) tonen de zuivering van de mitochondriale en membraanfracties (figuur 2). Het gebruik van een antilichaam tegen VDAC, een eiwit gelokaliseerd …

Discussion

Deze methode is een aangepaste versie van een eerder gepubliceerde benadering van subcellulaire fractionering zonder het gebruik van snelle centrifugatie11. Deze aangepaste methode vereist meer gespecialiseerde apparatuur om de beste resultaten te bereiken, maar is uitgebreider en consistent reproduceerbaar.

De ontwikkeling van het initiële protocol was noodzakelijk vanwege het onvermogen om mitochondriale en membraanmonsters te scheiden voor de analyse van eiwitlokali…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door NIH R15-HL135675-01 en NIH 2 R15-HL135675-02 aan T.J.L.

Materials

Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer Next Advance 61-BB50-DX
digitonin Sigma D141
end-over-end rotator ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Sigma E3889
GAPDH (14C10)  Cell Signalling Technologies 2118
HEPES VWR 97064-360
Hexylene glycol Sigma 68340
Igepal Sigma I7771 Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl Sigma P9333
Mannitol Sigma M9647
MgCl2 Sigma M8266
NaCl Sigma S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) Cell Signalling Technologies 23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm Seton Scientific 7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium Sigma D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use VWR M221-1ML
refrigerated centrifuge ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma 436143
Sodium deoxycholate Sigma D6750
sodium orthovanadate (SOV) Sigma 567540
sonicator ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm Next Advance SSB32
Sucrose Sigma S0389
Tris-buffered Saline (TBS) VWR 97062-370
Tween 20 non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12) Cell Signalling Technologies 4661

References

  1. Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, 440-445 (2015).
  2. Il Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
  3. Clayton, D. A., Shadel, G. S. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).
  4. Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses. Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
  5. Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
  6. Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
  7. Therien, A. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).
  8. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  9. Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
  10. Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).
  11. McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation. Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).
  12. McCaig, W. D., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).

Play Video

Cite This Article
McCaig, W. D., Deragon, M. A., Truong, P. V., Knapp, A. R., LaRocca, T. J. Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. J. Vis. Exp. (174), e62119, doi:10.3791/62119 (2021).

View Video