Summary

פיצול תאים של תאי U937 על ידי טיהור הדרגתי בצפיפות איזופיקנית

Published: August 12, 2021
doi:

Summary

פרוטוקול פיצול זה יאפשר לחוקרים לבודד חלבונים ציטופלסמיים, גרעיניים, מיטוכונדריאליים וממברנות מתאי יונקים. שני השברים התת-תאיים האחרונים מטוהרים עוד יותר באמצעות שיפוע צפיפות איזופיקני.

Abstract

פרוטוקול זה מתאר שיטה להשגת שברי חלבון תת-תאיים מתאי יונקים באמצעות שילוב של דטרגנטים, תזה מכנית וצנטריפוגה הדרגתית בצפיפות איזופיקנית. היתרון העיקרי של הליך זה הוא שהוא אינו מסתמך על השימוש הבלעדי בדטרגנטים מפריכים כדי להשיג שברים תת-תאיים. זה מאפשר להפריד את קרום הפלזמה מאברונים אחרים הקשורים לממברנה של התא. הליך זה יקל על קביעת לוקליזציה של חלבונים בתאים בשיטה ניתנת לשחזור, מדרגית וסלקטיבית. שיטה זו שימשה בהצלחה לבידוד חלבונים ציטוזוליים, גרעיניים, מיטוכונדריאליים וממברנות פלזמה מקו תאי המונוציטים האנושיים, U937. למרות שהוא ממוטב עבור קו תאים זה, הליך זה עשוי לשמש כנקודת התחלה מתאימה לפיצול תת-תאי של קווי תאים אחרים. מכשולים פוטנציאליים של ההליך וכיצד להימנע מהם נדונים כמו גם שינויים שאולי צריך לקחת בחשבון עבור קווי תאים אחרים.

Introduction

פיצול תת-תאי הוא הליך שבו תאים שוכבים ומופרדים למרכיביהם המרכיבים אותם באמצעות מספר שיטות. טכניקה זו יכולה לשמש חוקרים כדי לקבוע לוקליזציה של חלבונים בתאי יונקים או להעשרה של חלבונים בעלי שפע נמוך שאחרת לא היו ניתנים לגילוי. אמנם קיימות כיום שיטות לפיצול תת-תאי, וכך גם ערכות מסחריות שניתן לרכוש, אך הן סובלות מכמה מגבלות שהליך זה מנסה להתגבר עליהן. רוב שיטות חלוקת התאים מבוססות אך ורק על 1,2 על דטרגנטים, תוך הסתמכותעל שימוש במאגרים המכילים כמויות הולכות וגדלות של חומרי ניקוי כדי לבודד רכיבים תאיים שונים. בעוד ששיטה זו מהירה ונוחה, היא גורמת לשברים לא טהורים. אלה נועדו לאפשר לחוקרים לבודד בקלות מרכיב אחד או שניים של התא, אך אינם מורכבים מספיק כדי לבודד שברים תת-תאיים מרובים מדגימה בו זמנית. הסתמכות על דטרגנטים בלבד גורמת בדרך כלל לכך שאברונים סגורים בממברנה וממברנת הפלזמה מסולפת ללא הבחנה, מה שמקשה על הפרדת רכיבים אלה. סיבוך נוסף מהשימוש בערכות אלה הוא חוסר היכולת של החוקרים לשנות/לייעל אותן עבור יישומים ספציפיים, שכן רוב הרכיבים הם פורמולציות קנייניות. לבסוף, ערכות אלה יכולות להיות יקרות להחריד, עם מגבלות במספר השימושים שהופכות אותן לפחות אידיאליות עבור דגימות גדולות יותר.

למרות הזמינות של ערכות לבידוד מיטוכונדריה שאינן מסתמכות על חומרי ניקוי, הן אינן מיועדות לבודד את קרום הפלזמה ולהניב כמויות דגימה נמוכות משמעותית מפרוטוקולי בידודסטנדרטיים 3,4. בעוד ששיטות צנטריפוגה דיפרנציאליות גוזלות זמן רב יותר, לעתים קרובות הן יוצרות שברים נפרדים שלא ניתן להשיג באמצעות ערכות מבוססות דטרגנטיםבלבד 1. הפרדה ללא שימוש בלעדי בדטרגנטים מסיסים מאפשרת גם טיהור נוסף באמצעות שיפועים אולטרה-צנטריפוגציה וצפיפות איזופיקנית, וכתוצאה מכך פחות זיהום צולב. פרוטוקול פיצול זה מדגים את הבידוד של שברים תת-תאיים ממונוציטים U937 באמצעות שילוב של גישות מבוססות דטרגנטים וצנטריפוגות במהירות גבוהה. שיטה זו תאפשר בידוד של מרכיבי הממברנה הגרעינית, הציטופלסמית, המיטוכונדרית והפלזמה של תא יונק עם זיהום מינימלי בין השברים.

Protocol

1. הכינו מאגרים וריאגנטים הכינו פתרונות טריים של מעכבי פוספטאז ופרוטאז.הוסיפו 17.4 מ”ג של פנילמתנסולפוניל פלואוריד (PMSF) ל-1 מ”ל של 100% אתנול כדי להכין ציר של 100 mM.הערה: יש ללבוש ציוד מגן בעת טיפול בתסמונת קדם-וסתית, שכן הוא מסוכן בבליעה או בשאיפה ובמגע עם העור או העיניים. זה קורוזיבי לע…

Representative Results

תרשים זרימה סכמטי של הליך זה (איור 1) מסכם באופן חזותי את הצעדים שננקטו כדי לפרק בהצלחה U9375 תאים שגודלו בתרחיף. שברים שנאספו מראש שיפוע הצפיפות האיזופיקנית בנפחים שווים (1 מ”ל) מראים את הטיהור של שברי המיטוכונדריה והממברנה (איור 2). שימוש בנוגדן נג?…

Discussion

שיטה זו היא גרסה שונה של גישה שפורסמה בעבר לפיצול תת-תאי ללא שימוש בצנטריפוגהבמהירות גבוהה 11. שיטה שונה זו דורשת ציוד מיוחד יותר כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר, אך היא מקיפה יותר וניתנת לשחזור באופן עקבי.

פיתוח הפרוטוקול הראשוני היה הכרחי בשל חוסר יכולת להפר?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי NIH R15-HL135675-01 ו- NIH 2 R15-HL135675-02 ל- T.J.L.

Materials

Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer Next Advance 61-BB50-DX
digitonin Sigma D141
end-over-end rotator ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Sigma E3889
GAPDH (14C10)  Cell Signalling Technologies 2118
HEPES VWR 97064-360
Hexylene glycol Sigma 68340
Igepal Sigma I7771 Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl Sigma P9333
Mannitol Sigma M9647
MgCl2 Sigma M8266
NaCl Sigma S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) Cell Signalling Technologies 23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm Seton Scientific 7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium Sigma D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) Sigma P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use VWR M221-1ML
refrigerated centrifuge ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma 436143
Sodium deoxycholate Sigma D6750
sodium orthovanadate (SOV) Sigma 567540
sonicator ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm Next Advance SSB32
Sucrose Sigma S0389
Tris-buffered Saline (TBS) VWR 97062-370
Tween 20 non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12) Cell Signalling Technologies 4661

References

  1. Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, 440-445 (2015).
  2. Il Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
  3. Clayton, D. A., Shadel, G. S. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).
  4. Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses. Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
  5. Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
  6. Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
  7. Therien, A. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).
  8. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  9. Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
  10. Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).
  11. McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation. Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).
  12. McCaig, W. D., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).

Play Video

Cite This Article
McCaig, W. D., Deragon, M. A., Truong, P. V., Knapp, A. R., LaRocca, T. J. Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. J. Vis. Exp. (174), e62119, doi:10.3791/62119 (2021).

View Video