Systematische Scoring-Analyse für Darmentzündungen in einem Murine Dextran Natriumsulfat-induzierte Colitis Modell
Summary
Die systematische Bewertung von Darmentzündungen mit einem freien computergestützten System ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um histopathologische Veränderungen in Kolitismodellen, die durch das Vorhandensein von Geschwüren und entzündlichen Veränderungen gekennzeichnet sind, quantitativ zu vergleichen. Die auswertung der histologischen Colitis-Score-Bewertung stärkt klinische Beobachtungen und erleichtert die Dateninterpretation.
Abstract
Murine Colitis Modelle sind Werkzeuge, die ausgiebig in Studien verwendet werden, die auf das Verständnis der Pathobiologie von entzündlichen Darmerkrankungen konzentriert. Es müssen jedoch noch robuste Standards für eine objektive und reproduzierbare Quantifizierung der Schwere der Erkrankung festgelegt werden. Die meisten Kolitis-Analysemethoden basieren auf einer begrenzten histologischen Bewertung kleiner Darmsegmente, was zu partiellen oder voreingenommenen Analysen führt. Hier kombinieren wir hochauflösende Bildaufnahme und Längsschnittanalyse des gesamten Dickdarms, um Darmverletzungen und Ulzerationen im dextran Natriumsulfat (DSS) induzierten Modell der murinen Kolitis zu quantifizieren. Dieses Protokoll ermöglicht die Generierung objektiver und reproduzierbarer Ergebnisse ohne umfassende Benutzerschulung. Hier bieten wir umfassende Details zur Probenvorbereitung und Bildanalyse anhand von Datenbeispielen aus DSS-induzierter Kolitis. Diese Methode kann leicht an andere Modelle der murinen Kolitis angepasst werden, die erhebliche Entzündungen im Zusammenhang mit Schleimhautverletzungen haben. Wir zeigen, dass der Anteil der entzündeten/verletzten und erodierten/ulzerierten Schleimhaut im Verhältnis zur gesamten Länge des Dickdarms eng parallel zu klinischen Befunden wie Gewichtsverlust inmitten der DSS-induzierten Krankheitsprogression ist. Dieses histologische Protokoll bietet eine zuverlässige zeit- und kosteneffektive Hilfe bei der unvoreingenommenen Standardisierung von Analysen der Krankheitsaktivität in DSS-Kolitisexperimenten.
Introduction
Die gastrointestinale Epithelbarriere spielt eine zentrale Rolle bei der Trennung von luminalen Antigenen und Krankheitserregern aus den darunter liegenden Gewebeteilen1. Epithelverletzungen und Schleimhautwunden, die bei pathologischen Erkrankungen wie entzündlicher Darmerkrankungen (IBD), Ischämie oder chirurgischen Verletzungen auftreten, sind mit klinischen Symptomen verbunden, die Durchfall, Gewichtsverlust, Blut im Stuhl und Bauchschmerzen umfassen. Als Reaktion auf Verletzungen wandern Epithelzellen und vermehren sich, um Mukohautbarrieredefekte erneut zu epithelialisieren und zu reparieren. Die Auflösung der Entzündung und die Wiederherstellung der Mukosalintegrität sind entscheidend für die Wiederherstellung der Darmschleimhauthomöostase und Funktion2,3,4.
Verschiedene Tiermodelle wurden eingesetzt, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu untersuchen, die mit der Schädigung der Darmepithelbarriere verbunden sind. Gut etablierte und leicht anwendbare Modelle chemisch induzierter Kolitis sind weit verbreitet, insbesondere in Studien im Zusammenhang mit entzündlichen Verletzungen wie IBD. Ein gemeinsames, reproduzierbares und zuverlässiges muriner Kolitismodell verwendet Dextran-Natriumsulfat (DSS) vermittelte Darmverletzungen und Entzündungen. Der Schweregrad der Erkrankung variiert je nach Mausstamm, DSS-Dosis, Länge der DSS-Verabreichung und Molekulargewicht von DSS5,6,7.
Darmschleimhautschäden während DSS-Kolitis werden in der Regel mit dem Disease Activity Index (DAI) bewertet, einem zusammengesetzten Score, der durch Gewichtsverlust, Fäkalienblutgehalt und Stuhlkonsistenz bestimmt wird. Der Fäkalienblutgehalt kann mikroskopisch (mit einem Stuhlguainsäuretest nachgewiesen) oder makroskopisch sein; Die Fäkalienkonsistenz wird als hart, weich oder flüssig (d. h. Durchfall)5,8klassifiziert. Die Bewertung dieser klinischen Parameter kann subjektiv sein und je nach Erfahrung und Voreingenommenheit des Benutzers variieren, obwohl die Daten insgesamt zuverlässige Informationen liefern und daher von IBD-Forschern weit verbreitet sind. Im Gegensatz dazu gibt es keine allgemein anerkannte Methode zur histologischen Bewertung von Schleimhautschäden. Am häufigsten werden ausgewählte Bereiche des Dickdarms von einem ausgebildeten Pathologen untersucht und basierend auf mehreren Parametern bewertet, die in der Regel Kryptoverletzung und Leukozyteninfiltration9,10,11umfassen. Da jedoch die Anzahl der untersuchten Parameter und die Menge des analysierten Gewebes zwischen den einzelnen Berichten sehr unterschiedlich sind, ist die Vergleichbarkeit vieler veröffentlichter Studien begrenzt. Um die Voreingenommenheit der Beobachter zu verringern und die Übereinstimmung zwischen den Studien zu verbessern, sollte ein ideales histologisches Bewertungsprotokoll sein: 1) die gesamte Länge des Dickdarms umfassen, da Darmschleimhautentzündungen am häufigsten variabel sind und Übersprungläsionen häufig sind, 2) die Analyse auf bestimmte Schlüssel und leicht interpretierbare Parameter beschränken, um die Subjektivität zu reduzieren, 3) eine schnelle, konsistente Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben zu ermöglichen und 4) weit verfügbare und erschwingliche Werkzeuge für die Datenerfassung, -analyse und -darstellung zu verwenden.
Hier beschreiben wir eine Technik zur Verarbeitung des gesamten Dickdarms oder der langen Segmente des Dünndarms in einer “Swiss Roll”-Konfiguration zusammen mit dem Einsatz eines kostenlosen computergestützten Scoring-Systems zur Analyse von Darmschleimhautentzündungen und -schäden aufgrund von DSS-induzierter Kolitis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unser histologisches Colitis Score-System stellt ein zuverlässiges Werkzeug dar, um Gewebeentzündungen und Schäden im Darm zu quantifizieren. Dieser Ansatz bietet ein besseres Verständnis des histopathologischen Zustands des gesamten Organs, ohne dass die Voreingenommenheit bei der Auswahl kleiner Bereiche oder unvollständiger Abschnitte besteht. Zu den entscheidenden Schritten zur erfolgreichen Ausführung dieses Protokolls gehören die ordnungsgemäße Aufbereitung von Schweizer Walzen, die eine Analyse von mindes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die Unterstützung durch die NIH-Förderung DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 und die University of Michigan Pathology Slide Scanning Services würdigen.
Materials
| Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher scientific | 14-823-2A | |
| Bonn Strabismus Scissors – ToughCut | Fine Science tools | 11103-09 | |
| Bonn Strabismus Scissors – ToughCut | Fine Science tools | 14084-09 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11251-20 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% denatured ethyl alcohol | |
| ImageScope | Aperio | Version 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/ |
| LeakBuster Specimen Containers: Sterile | Starplex Scientific | B120210 | |
| Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm | Instech | FTP2030 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305176 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305109 | |
| Syringe, 10 ml | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302995 | |
| Unisette Tissue Cassettes | Simport | M505-2 |
References
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