ניתוח ניקוד שיטתי עבור דלקת מעיים במודל קוליטיס נתרן סולפט הנגרמת על ידי מורין
Summary
ניקוד שיטתי של דלקת מעיים באמצעות מערכת חופשית בסיוע מחשב הוא כלי רב עוצמה להשוות כמותית שינויים היסטופטולוגיים במודלים קוליטיס המאופיינת על ידי נוכחות של כיבים ושינויים דלקתיים. הערכת ניקוד קוליטיס היסטולוגית מחזקת תצפיות קליניות ומאפשרת פרשנות נתונים.
Abstract
מודלים קוליטיס מורין הם כלים כי הם מועסקים בהרחבה במחקרים התמקדו בהבנת הפתוביולוגיה של הפרעות מעיים דלקתיות. עם זאת, סטנדרטים חזקים לכימות אובייקטיבי וניתן לשחזור של חומרת המחלה נשארים מוגדרים. רוב שיטות ניתוח קוליטיס מסתמכות על ניקוד היסטולוגי מוגבל של מקטעים קטנים של המעי, מה שמוביל לניתוחים חלקיים או מוטים. כאן, אנו משלבים רכישת תמונה ברזולוציה גבוהה וניתוח אורך של המעי הגס כולו כדי לכמת פגיעה במעיים וכיב במודל דקסטרן נתרן גופרתי (DSS) המושרה של קוליטיס מורין. פרוטוקול זה מאפשר יצירת תוצאות אובייקטיביות ושחזוריות ללא הכשרה נרחבת של המשתמש. כאן, אנו מספקים פרטים מקיפים על הכנת מדגם וניתוח תמונה באמצעות דוגמאות של נתונים של קוליטיס המושרה DSS. שיטה זו יכולה להיות מותאמת בקלות מודלים אחרים של קוליטיס מורין כי יש דלקת משמעותית הקשורים לפגיעה הרירית. אנו מראים כי השבר של רירית מודלקת/פצועה ושחוקה/כיבית ביחס לאורך המלא של המעי הגס מקבילה באופן הדוק לממצאים קליניים כגון ירידה במשקל בין התקדמות המחלה הנגרמת על ידי DSS. פרוטוקול היסטולוגי זה מספק זמן אמין וסיוע חסכוני לתקנן ניתוחים של פעילות המחלה בצורה לא משוחדת בניסויי קוליטיס DSS.
Introduction
מחסום האפיתל במערכת העיכול ממלא תפקיד מרכזי בהפרדת אנטיגנים ופתוגנים לומינליים מתאי הרקמות הבסיסיים1. פגיעה אפיתל ופצעים ריר לראות בתנאים פתולוגיים כגון מחלות מעי דלקתיות (IBD), איסכמיה, או פציעה כירורגית קשורים עם תסמינים קליניים הכוללים שלשולים, ירידה במשקל, דם בצואה, וכאבי בטן. בתגובה לפציעה, תאי אפיתל נודדים ומתרבים כדי לאפיתל מחדש ולתקן פגמים במחסום הרירית. רזולוציה של דלקת והחזרת שלמות הרירית חיוניים להקמה מחדש של הומאוסטזיס הרירית במעיים ולתפקד2,3,4.
מודלים שונים של בעלי חיים שימשו כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים הבסיסיים הקשורים לפגיעה במחסום האפיתל במעיים. מודלים מבוססים היטב וישימים בקלות של קוליטיס המושרה כימית נמצאים בשימוש נרחב, במיוחד במחקרים הקשורים לפגיעה דלקתית כגון מחלות מעי דלקתיות. דגם קוליטיס מורין נפוץ, ניתן לשחזור ואמין מעסיק נתרן גופרתי (DSS) בתיווך פגיעה במעי הגס ודלקת. חומרת המחלה משתנה בהתאם לזן העכבר, מינון של DSS, אורך ניהול DSS, ומשקל מולקולרי של DSS5,6,7.
נזק ריר מעיים במהלך קוליטיס DSS מוערך בדרך כלל באמצעות מדד פעילות המחלה (DAI), ציון מרוכב שנקבע על ידי ירידה במשקל, תוכן דם צואה, ועקביות צואה. תכולת הדם בצואה יכולה להיות מיקרוסקופית (מזוהה באמצעות בדיקת חומצה guaiac צואה) או מקרוסקופי; עקביות צואה מסווגת קשה, רך, או נוזלי (כלומר, שלשול)5,8. ניקוד של פרמטרים קליניים אלה יכול להיות סובייקטיבי ועשוי להשתנות בהתאם לניסיון של המשתמש והטיה, אם כי בסך הכל, הנתונים מספקים מידע אמין ולכן נמצא בשימוש נרחב על ידי חוקרי IBD. לעומת זאת, אין שיטה מקובלת להערכה היסטולוגית של נזקי ריר. לרוב, אזורים נבחרים של המעי הגס נבדקים על ידי פתולוג מיומן וציון בהתבסס על מספר פרמטרים הכוללים בדרך כלל פגיעה בקריפטה וחדירת לויקוציטים9,10,11. עם זאת, מכיוון שמספר הפרמטרים שנחקרו וכמות הרקמות שנותחו משתנה במידה ניכרת בין דוחות בודדים, ההסתגלות של מחקרים רבים שפורסמו מוגבלת. כדי להפחית את הטיית הצופה ולשפר את הקונקורדנציה הבין-מחקרית, פרוטוקול ניקוד היסטולוגי אידיאלי צריך: 1) לכלול את כל אורך המעי הגס, שכן דלקת הרירית במעיים היא לרוב משתנה ולדלג על נגעים נפוצים, 2) להגביל ניתוח לפרמטרים ספציפיים מפתח קל לפרשנות כדי להפחית את הסובייקטיביות, 3) להקל על עיבוד מהיר ועקבי של מספר גדול של דגימות, ו 4) להשתמש בכלים זמינים ובמחיר סביר נרחב לרכישת נתונים, ניתוח ומצגת.
כאן אנו מתארים טכניקה לעבד את המעי הגס כולו או קטעים ארוכים של המעי הדק בתצורת “רול שוויצרי” יחד עם השימוש במערכת ניקוד בסיוע מחשב חינם כדי לנתח דלקת ריר מעיים ונזק בגלל קוליטיס הנגרמת על ידי DSS.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכת הקוליטיס ההיסטולוגית שלנו מהווה כלי אמין לכימות דלקת רקמות ונזק במעי. גישה זו מספקת הבנה משופרת של המצב ההיסטופטולוגי של האיבר כולו ללא הטיה של בחירת אזורים קטנים או קטעים לא שלמים. בין הצעדים הקריטיים לביצוע מוצלח של פרוטוקול זה ניתן למנות הכנה נכונה של לחמניות שוויצריות המאפשרות ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להכיר בתמיכה של NIH מימון DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 ושירותי סריקת שקופיות פתולוגיה של אוניברסיטת מישיגן.
Materials
| Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning | Leica Biosystems | Aperio AT2 | |
| Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier | VWR International | 56616-032 | |
| American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg | GT Midwest | TL5837 | |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher scientific | 14-823-2A | |
| Bonn Strabismus Scissors – ToughCut | Fine Science tools | 11103-09 | |
| Bonn Strabismus Scissors – ToughCut | Fine Science tools | 14084-09 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science tools | 11251-20 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma | HT501640-19L | |
| HistoPrep 70% Ea | Fisherbran | 70% denatured ethyl alcohol | |
| ImageScope | Aperio | Version 12.3.3.5039 | http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/ |
| LeakBuster Specimen Containers: Sterile | Starplex Scientific | B120210 | |
| Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm | Instech | FTP2030 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305176 | |
| PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in | BD (Becton, Dickinson and Company) | 305109 | |
| Syringe, 10 ml | BD (Becton, Dickinson and Company) | 302995 | |
| Unisette Tissue Cassettes | Simport | M505-2 |
References
- Kagnoff, M. F. The intestinal epithelium is an integral component of a communications network. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 2841-2843 (2014).
- Laukoetter, M. G., Nava, P., Nusrat, A. Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (3), 401-407 (2008).
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Ordas, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
- Vowinkel, T., Kalogeris, T. J., Mori, M., Krieglstein, C. F., Granger, D. N. Impact of dextran sulfate sodium load on the severity of inflammation in experimental colitis. Digestive Diseases and Sciences. 49 (4), 556-564 (2004).
- Kitajima, S., Takuma, S., Morimoto, M. Histological analysis of murine colitis induced by dextran sulfate sodium of different molecular weights. Experimental Animals. 49 (1), 9-15 (2000).
- Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. American Journal of Physiology. 274 (3), 544-551 (1998).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2 (3), 541-546 (2007).
- Kozlowski, C., et al. An entirely automated method to score DSS-induced colitis in mice by digital image analysis of pathology slides. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 855-865 (2013).
- Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 718617 (2012).
- Mizoguchi, A. Animal models of inflammatory bowel disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 105, 263-320 (2012).
- Flemming, S., et al. Desmocollin-2 promotes intestinal mucosal repair by controlling integrin-dependent cell adhesion and migration. Molecular Biology of the Cell. 31 (6), 407-418 (2020).
- Luna, L. G. . Armed Forces Institute of Pathology (U.S) & Armed Forces Institute of Pathology (U.S.). Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3d edn. , (1968).
- Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. The Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
- Reed, M., et al. Epithelial CD47 is critical for mucosal repair in the murine intestine in vivo. Nature Communications. 10 (1), 5004 (2019).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
- Khounlotham, M., et al. Compromised intestinal epithelial barrier induces adaptive immune compensation that protects from colitis. Immunity. 37 (3), 563-573 (2012).
