Summary

Systematische scoringsanalyse voor darmontsteking in een muriene dextran natriumsulfaat-geïnduceerde colitismodel

Published: February 14, 2021
doi:

Summary

Systematische scoring van darmontsteking met behulp van een gratis computerondersteund systeem is een krachtig hulpmiddel om histopathologische veranderingen in colitismodellen kwantitatief te vergelijken, gekenmerkt door de aanwezigheid van zweren en ontstekingsveranderingen. Histologische colitis score evaluatie versterkt klinische observaties en vergemakkelijkt de interpretatie van gegevens.

Abstract

Murine colitis modellen zijn hulpmiddelen die uitgebreid worden gebruikt in studies gericht op het begrijpen van de pathobiologie van inflammatoire darmaandoeningen. Er moeten echter nog robuuste normen worden vastgesteld voor objectieve en reproduceerbare kwantificering van de ernst van de ziekte. De meeste colitis-analysemethoden zijn gebaseerd op beperkte histologische scoring van kleine darmsegmenten, wat leidt tot gedeeltelijke of bevooroordeelde analyses. Hier combineren we beeldverwerving met hoge resolutie en longitudinale analyse van de hele dikke darm om darmletsel en ulceratie te kwantificeren in het door dextrannatriumsulfaat (DSS) geïnduceerde model van muriene colitis. Dit protocol maakt het mogelijk om objectieve en reproduceerbare resultaten te genereren zonder uitgebreide gebruikerstraining. Hier bieden we uitgebreide details over monstervoorbereiding en beeldanalyse aan de hand van voorbeelden van gegevens van DSS-geïnduceerde colitis. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast aan andere modellen muriene colitis die significante ontsteking hebben geassocieerd met mucosale letsel. We tonen aan dat de fractie ontstoken/gewond en geërodeerd/gezwollen slijmvlies ten opzichte van de volledige lengte van de dikke darm nauw parallel loopt met klinische bevindingen zoals gewichtsverlies te midden van DSS-geïnduceerde ziekteprogressie. Dit histologische protocol biedt een betrouwbare tijd en kosteneffectieve hulp om analyses van ziekteactiviteit op een onbevooroordete manier te standaardiseren in DSS-colitis-experimenten.

Introduction

De gastro-intestinale epitheelbarrière speelt een cruciale rol bij het scheiden van luminale antigenen en pathogenen van onderliggende weefselcompartimenten1. Epitheliaal letsel en mucosale wonden gezien in pathologische aandoeningen zoals inflammatoire darmziekte (IBD), ischemie of chirurgisch letsel worden geassocieerd met klinische symptomen zoals diarree, gewichtsverlies, bloed in de ontlasting en buikpijn. Als reactie op letsel migreren en verspreiden epitheelcellen zich om mucosale barrièredefecten opnieuw te epithelialiseren en te herstellen. Oplossing van ontsteking en restitutie van mucosale integriteit zijn cruciaal voor het herstellen van intestinale mucosale homeostase en functie2,3,4.

Verschillende diermodellen zijn gebruikt om de onderliggende moleculaire mechanismen te bestuderen die verband houden met de schade aan de intestinale epitheelbarrière. Gevestigde en gemakkelijk toepasbare modellen van chemisch geïnduceerde colitis worden veel gebruikt, met name in studies met betrekking tot ontstekingsletsel zoals IBD. Een gemeenschappelijk, reproduceerbaar en betrouwbaar murine colitis model maakt gebruik van dextran natriumsulfaat (DSS) gemedieerde darmletsel en ontsteking. De ernst van de ziekte varieert afhankelijk van de muisstam, dosis DSS, de duur van de toediening van DSS en het molecuulgewicht van DSS5,6,7.

Intestinale mucosale schade tijdens DSS-colitis wordt meestal geëvalueerd met behulp van de Disease Activity Index (DAI), een samengestelde score die wordt bepaald door gewichtsverlies, fecaal bloedgehalte en ontlastingsconsistentie. Het fecale bloedgehalte kan microscopisch (gedetecteerd met behulp van een guaiaczuurtest in de ontlasting) of macroscopisch zijn; fecale consistentie wordt geclassificeerd als hard, zacht of vloeibaar (d.w.z. diarree)5,8. Het scoren van deze klinische parameters kan subjectief zijn en kan variëren afhankelijk van de ervaring en bias van de gebruiker, hoewel de gegevens over het algemeen betrouwbare informatie bieden en dus veel worden gebruikt door IBD-onderzoekers. Daarentegen is er geen algemeen aanvaarde methode voor histologische evaluatie van mucosale schade. Meestal worden geselecteerde delen van de dikke darm geïnspecteerd door een getrainde patholoog en gescoord op basis van verschillende parameters, waaronder crypteletsel en leukocyteninfiltratie9,10,11. Omdat het aantal onderzochte parameters en de hoeveelheid geanalyseerd weefsel echter aanzienlijk varieert tussen individuele rapporten, is de vergelijkbaarheid van veel gepubliceerde studies beperkt. Om de bias van waarnemers te verminderen en de concordantie tussen studies te verbeteren, moet een ideaal histologisch scoreprotocol: 1) de volledige lengte van de dikke darm omvatten, omdat darmslijmvliesontsteking meestal variabel is en skip-laesies gebruikelijk zijn, 2) analyse beperken tot specifieke sleutel en gemakkelijk interpreteerbare parameters om subjectiviteit te verminderen, 3) snelle, consistente verwerking van grote aantallen monsters vergemakkelijken en 4) breed beschikbare en betaalbare tools gebruiken voor het verzamelen, analyseren en presenteren van gegevens.

Hier beschrijven we een techniek om de hele dikke darm of lange segmenten van de dunne darm te verwerken in een “Swiss roll” -configuratie, samen met het gebruik van een gratis computerondersteund scoresysteem om darmslijmvliesontsteking en schade als gevolg van DSS-geïnduceerde colitis te analyseren.

Protocol

Alle beschreven dierproeven werden goedgekeurd door het Committee on the Use and Care of Animals van de Universiteit van Michigan. 1. Weefseloogst Euthanaseer muizen op humane wijze met behulp van isofluraan anesthesie gevolgd door cervicale dislocatie, in overeenstemming met goedgekeurde protocollen. Voor alle dierproeven is goedkeuring verkregen door een gecertificeerde beoordelingscommissie in overeenstemming met de nationale en institutionele richtlijnen voor de behandeling van d…

Representative Results

Om de betrouwbaarheid van deze Histologische Colitis Score Analyse te illustreren in de context van mucosale schade na DSS uitdaging en daaropvolgend herstel van colitis, hebben we 2,5% DSS toegediend in het drinkwater van acht 10 weken oude mannelijke C57BL6 wilde type muizen gedurende 5 dagen gevolgd door een herstelperiode met regelmatig water gedurende 5 dagen. Er was geen verandering in lichaamsgewicht tijdens de acute toediening van DSS, van dag 0 tot 5 (figuur …

Discussion

Ons Histologisch Colitis Score systeem is een betrouwbaar hulpmiddel om weefselontsteking en schade in de darm te kwantificeren. Deze benadering biedt een beter begrip van de histopathologische toestand van het hele orgaan zonder de bias van het selecteren van kleine gebieden of onvolledige secties. Een van de kritieke stappen om dit protocol met succes uit te voeren, is een goede voorbereiding van Zwitserse rollen die analyse van ten minste 90% van de lengte van de dikke darm mogelijk maken; parallelle oriëntatie tijde…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen steun van NIH-financiering DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 en de University of Michigan Pathology Slide Scanning Services erkennen.

Materials

Aperio AT2 – High Volume, Digital Whole Slide Scanning Leica Biosystems Aperio AT2
Absorbent Underpads with waterproof moisture barrier VWR International 56616-032
American Line 66-0089 Single Edge Blade, 100 per pkg GT Midwest TL5837
BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles Fisher scientific 14-823-2A
Bonn Strabismus Scissors – ToughCut Fine Science tools 11103-09
Bonn Strabismus Scissors – ToughCut Fine Science tools 14084-09
Dumont #5 Forceps Fine Science tools 11251-20
Formalin solution, neutral buffered, 10% Sigma HT501640-19L
HistoPrep 70% Ea Fisherbran 70% denatured ethyl alcohol
ImageScope Aperio Version 12.3.3.5039 http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/
LeakBuster Specimen Containers: Sterile Starplex Scientific B120210
Phosphate-Buffere Saline, without calcium & magnesium Corning 21-040-CV
Plastic Feeding tubes, 20 GA x 30 mm Instech FTP2030
PrecisionGlide Needle, Size: 20 G x 1 1/2 in BD (Becton, Dickinson and Company) 305176
PrecisionGlide Needle, Size: 27 G x 1/2 in BD (Becton, Dickinson and Company) 305109
Syringe, 10 ml BD (Becton, Dickinson and Company) 302995
Unisette Tissue Cassettes Simport M505-2

References

  1. Kagnoff, M. F. The intestinal epithelium is an integral component of a communications network. Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 2841-2843 (2014).
  2. Laukoetter, M. G., Nava, P., Nusrat, A. Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (3), 401-407 (2008).
  3. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
  4. Ordas, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Ulcerative colitis. Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).
  5. Vowinkel, T., Kalogeris, T. J., Mori, M., Krieglstein, C. F., Granger, D. N. Impact of dextran sulfate sodium load on the severity of inflammation in experimental colitis. Digestive Diseases and Sciences. 49 (4), 556-564 (2004).
  6. Kitajima, S., Takuma, S., Morimoto, M. Histological analysis of murine colitis induced by dextran sulfate sodium of different molecular weights. Experimental Animals. 49 (1), 9-15 (2000).
  7. Mahler, M., et al. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis. American Journal of Physiology. 274 (3), 544-551 (1998).
  8. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2 (3), 541-546 (2007).
  9. Kozlowski, C., et al. An entirely automated method to score DSS-induced colitis in mice by digital image analysis of pathology slides. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 855-865 (2013).
  10. Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 718617 (2012).
  11. Mizoguchi, A. Animal models of inflammatory bowel disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 105, 263-320 (2012).
  12. Flemming, S., et al. Desmocollin-2 promotes intestinal mucosal repair by controlling integrin-dependent cell adhesion and migration. Molecular Biology of the Cell. 31 (6), 407-418 (2020).
  13. Luna, L. G. . Armed Forces Institute of Pathology (U.S) & Armed Forces Institute of Pathology (U.S.). Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3d edn. , (1968).
  14. Kelm, M., et al. Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis. The Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).
  15. Reed, M., et al. Epithelial CD47 is critical for mucosal repair in the murine intestine in vivo. Nature Communications. 10 (1), 5004 (2019).
  16. Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).
  17. Khounlotham, M., et al. Compromised intestinal epithelial barrier induces adaptive immune compensation that protects from colitis. Immunity. 37 (3), 563-573 (2012).

Play Video

Cite This Article
Garcia-Hernandez, V., Neumann, P., Koch, S., Lyons, R., Nusrat, A., Parkos, C. A. Systematic Scoring Analysis for Intestinal Inflammation in a Murine Dextran Sodium Sulfate-Induced Colitis Model. J. Vis. Exp. (168), e62135, doi:10.3791/62135 (2021).

View Video