In Vitro 3D Cultivos Celulares Modelos Arteriales Para El Estudio De La Droga Vascular Dirigida Bajo Flujo
Summary
Aquí, presentamos un nuevo protocolo para estudiar y trazar la deposición apuntada de portadores de la droga a las células endoteliales en modelos humanos fabricados, de tamaño real, tridimensionales de la arteria bajo flujo fisiológico. El actual método puede servir como nueva plataforma para apuntar a portadores de la droga dentro del sistema vascular.
Abstract
El uso de modelos tridimensionales (3D) de arterias humanas, que están diseñados con las dimensiones y la anatomía correctas, permite el modelado adecuado de varios procesos importantes en el sistema cardiovascular. Recientemente, aunque varios estudios biológicos se han realizado usando tales modelos 3D de arterias humanas, no se han aplicado para estudiar la blanco vascular. Este papel presenta un nuevo método para fabricar los modelos arteriales humanos reales,reconstruidos usando una técnica de impresión 3D, para alinearlos con las células endoteliales humanas (ECs), y para estudiar la partícula que apunta bajo flujo fisiológico. Estos modelos tienen la ventaja de replicar el tamaño fisiológico y las condiciones de los vasos sanguíneos en el cuerpo humano utilizando componentes de bajo costo. Esta técnica puede servir como una nueva plataforma para estudiar y comprender la focalización de fármacos en el sistema cardiovascular y puede mejorar el diseño de nuevas nanomedicinas inyectables. Por otra parte, el actual acercamiento puede proporcionar las herramientas significativas para el estudio de la entrega apuntada de diversos agentes para las enfermedades cardiovasculares bajo flujo paciente-específico y condiciones fisiológicas.
Introduction
Recientemente se han aplicado varios enfoques utilizando modelos 3D de arterias humanas1,2,3,4,5. Estos modelos replican in vitrola anatomía fisiológica y el entorno de diferentes arterias del cuerpo humano. Sin embargo, se han utilizado principalmente en estudios de biología celular. Los estudios actuales sobre la focalización vascular de partículas al endotelio incluyen simulaciones computacionales in silico 6,7,8,modelos microfluídicos in vitro 9,10,11,y modelos animales in vivo 12. A pesar de los conocimientos que han proporcionado, estos modelos experimentales no han podido simular con precisión el proceso de focalización que se produce en las arterias humanas, en el que el flujo sanguíneo y la hemodinámica constituyen factores dominantes. Por ejemplo, el estudio de la focalización de partículas a regiones ateroscleróticas en la bifurcación de la arteria carótida, que son conocidas por su complejo patrón de flujo de recirculación y gradiente de tensión de cizalladura de la pared, puede afectar el viaje realizado por las partículas antes de que lleguen al endotelio13,14,15,16. Por lo tanto, estos estudios deben realizarse en condiciones que repliquen el entorno fisiológico, es decir,el tamaño, la dimensión, la anatomía y el perfil de flujo.
Recientemente, este grupo de investigación fabricó modelos arteriales humanos reconstruidos en 3D para estudiar la deposición y focalización de partículas a la vasculatura17. Los modelos se basaron en réplicas geométricas en 3D de los vasos sanguíneos humanos, que luego se cultivaron con CE humanas que posteriormente alinearon sus paredes internas. Además, cuando se someten a un sistema de perfusión que produce flujo fisiológico, los modelos replican con precisión las condiciones fisiológicas. El sistema de perfusión fue diseñado para perfundir fluidos a un caudal constante, utilizando una bomba peristáltica tanto en configuraciones de circuito cerrado como abierto (Figura 1). El sistema se puede utilizar como un circuito cerrado para mapear la deposición de partículas y la focalización a las células sembradas dentro del modelo carotídeo. Además, se puede utilizar como un circuito abierto para lavar las partículas no adherentes al final de los experimentos y para limpiar y mantener el sistema. Este papel presenta los protocolos para la fabricación de los modelos 3D de la bifurcación carótida humana, el diseño del sistema de la perfusión, y el trazado de la deposición de partículas apuntadas dentro de los modelos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los enfoques actuales para estudiar la focalización vascular de las partículas se quedan cortos en la replicación de las condiciones fisiológicas presentes en el cuerpo humano. Aquí se presenta un protocolo para fabricar modelos reconstruidos en 3D de arterias humanas para estudiar la orientación de partículas a los CE que recubren la arteria bajo flujo fisiológico aplicado utilizando un sistema de perfusión personalizado. Al elegir el material para la impresión 3D, lo mejor es utilizar un plástico transparent…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Israel Science Foundation (subvención ISF # 902/18). La beca de Maria Khoury fue apoyada por el Programa de Doctorado de Mujeres baronesa Ariane de Rothschild.
Materials
| 3D printer | FormLabs | PKG-F2-REFURB | |
| Acetone, absolute (AR grade) | |||
| Connectors | Nordson Medical | FTLL013-1 | Female Luer |
| FTLL230-1 | Female Luer | ||
| FTLL360-1 | Female Luer | ||
| LP4-1 | Male Luer Integral Lock | ||
| Damper | Thermo-Fisher Scientific | DS2127-0250 | Nalgene Polycarbonate, Validation Bottle |
| Damper Cover | Thermo-Fisher Scientific | 2162-0531 | Nalgene Filling/Venting Closures |
| Elastosil Elastosil RT 601 A | Wacker | 60003805 | |
| Elastosil RT 601 B | Wacker | 60003817 | The crosslinker |
| Endothelial Cell Media | ScienCell | 1001 | |
| Fibrontectin | Sigma Aldrich | F0895-5mg | |
| HUVEC | Lonza | CC-2519 | |
| Isopropyl alcohol, AR grade 99.5% | Remove plastic dust from the sanded model | ||
| Lacquer | Rust-Oleum | 2X-Ultra cover Gloss Clear | |
| Matlab | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Microscope | Nikon | SMZ25 | |
| Microscope Camera | Nikon | DS-Qi2 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | 530U IP31 | With 2 pumpheads: 313D |
| Plastic tube clamp | Quickun | 1-2240-stopvalve-2pcs | |
| Polystyrene Particles | Thermo-Fisher Scientific | F8827 | Diameter = 2 µm |
| Printer resin | FormLabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| Rotator | ELMI Ltd. | Intelli-Mixer RM-2 | |
| Solidworks | SolidWorks Corp., Dassault Systèmes | https://www.solidworks.com/ | |
| Tubing | Watson Marlow | 933.0064.016 | Tubing for the pump: 6.4 mm ID |
| All the other tubing: Silicon tubing: 4 mm ID |
References
- Chiu, J. J., et al. Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells. Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).
- Martorell, J., et al. Extent of flow recirculation governs expression of atherosclerotic and thrombotic biomarkers in arterial bifurcations. Cardiovascular Research. 103 (1), 37-46 (2014).
- Karino, T., Goldsmith, H. L. Flow behaviour of blood cells and rigid spheres in an annular vortex. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 279 (967), 413-445 (1977).
- Goldsmith, H. L., Karino, T. Platelets in a region of disturbed flow. Transactions – American Society for Artificial Internal Organs. 23, 632-638 (1977).
- Farcas, M. A., Rouleau, L., Fraser, R., Leask, R. L. The development of 3-D, in vitro, endothelial culture models for the study of coronary artery disease. Biomedical Engineering Online. 8, 30 (2009).
- Peng, B., et al. Modeling nanoparticle targeting to a vascular surface in shear flow through diffusive particle dynamics. Nanoscale Research Letters. 10 (1), 942 (2015).
- Shah, S., Liu, Y., Hu, W., Gao, J. Modeling particle shape-dependent dynamics in nanomedicine. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 11 (2), 919-928 (2011).
- Hossain, S. S., Hughes, T. J., Decuzzi, P. Vascular deposition patterns for nanoparticles in an inflamed patient-specific arterial tree. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 585-597 (2014).
- Charoenphol, P., Huang, R. B., Eniola-Adefeso, O. Potential role of size and hemodynamics in the efficacy of vascular-targeted spherical drug carriers. Biomaterials. 31 (6), 1392-1402 (2010).
- Ta, H. T., Truong, N. P., Whittaker, A. K., Davis, T. P., Peter, K. The effects of particle size, shape, density and flow characteristics on particle margination to vascular walls in cardiovascular diseases. Expert Opinion on Drug Delivery. 15 (1), 33-45 (2018).
- Cooley, M., et al. Influence of particle size and shape on their margination and wall-adhesion: implications in drug delivery vehicle design across nano-to-micro scale. Nanoscale. 10 (32), 15350-15364 (2018).
- Jiang, X. Y., et al. Quantum dot interactions and flow effects in angiogenic zebrafish (Danio rerio) vessels and human endothelial cells. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (3), 999-1010 (2017).
- Zarins, C. K., et al. Carotid bifurcation atherosclerosis. Quantitative correlation of plaque localization with flow velocity profiles and wall shear stress. Circulation Research. 53 (4), 502-514 (1983).
- Chien, S. Effects of disturbed flow on endothelial cells. Annals of Biomedical Engineering. 36 (4), 554-562 (2008).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. JAMA. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- Glagov, S., Zarins, C., Giddens, D. P., Ku, D. N. Hemodynamics and atherosclerosis. Insights and perspectives gained from studies of human arteries. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 112 (10), 1018-1031 (1988).
- Khoury, M., Epshtein, M., Zidan, H., Zukerman, H., Korin, N. Mapping deposition of particles in reconstructed models of human arteries. Journal of Controlled Release. 318, 78-85 (2020).
