بروتوكولات تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمية لقطرات النسخ العكسي المكونة من خطوتين للكشف عن SARS-CoV-2 وقياسه
Summary
يلخص هذا العمل خطوات تطوير فحوصات مختلفة للكشف عن SARS-CoV-2 باستخدام نظام ddPCR بلونين. الخطوات مفصلة وتم تضمين ملاحظات حول كيفية تحسين المقايسات وأداء التجربة. يمكن استخدام هذه المقايسات للعديد من تطبيقات SARS-CoV-2 RT-ddPCR.
Abstract
يعد تشخيص جائحة SARS-CoV-2 المستمرة أولوية لجميع البلدان في جميع أنحاء العالم. حاليا ، يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي (RT-qPCR) هو المعيار الذهبي لتشخيص SARS-CoV-2 حيث لا يتوفر حل دائم. على الرغم من فعالية هذه التقنية ، فقد ظهرت الأبحاث التي تظهر حدودها في الكشف والتشخيص خاصة عندما يتعلق الأمر بالأهداف الوفيرة المنخفضة. في المقابل ، ثبت أن تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي بالقطرات (ddPCR) ، وهي تقنية ناشئة حديثة ذات مزايا فائقة على qPCR ، تتغلب على تحديات RT-qPCR في تشخيص SARS-CoV-2 من عينات مستهدفة منخفضة الوفرة. في المستقبل ، في هذه المقالة ، يتم توسيع قدرات RT-ddPCR بشكل أكبر من خلال إظهار خطوات حول كيفية تطوير مقايسات المسبار البسيط ، والمزدوج ، والثلاثي ، والرباعي باستخدام نظام الكشف بلونين. باستخدام الاشعال والمجسات التي تستهدف مواقع محددة من جينوم SARS-CoV-2 (N و ORF1ab و RPP30 و RBD2) ، تبين أن تطوير هذه المقايسات ممكن. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير بروتوكولات مفصلة خطوة بخطوة وملاحظات واقتراحات حول كيفية تحسين سير عمل المقايسات وتحليل البيانات. سيضمن تكييف سير العمل هذا في الأعمال المستقبلية إمكانية اكتشاف الحد الأقصى لعدد الأهداف بحساسية في عينة صغيرة مما يحسن بشكل كبير التكلفة وإنتاجية العينة.
Introduction
شهد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، وهو تقنية معترف بها جيدا ، العديد من التحولات منذ ظهوره ليصبح تقنية قوية قادرة على تقديم إجابات لأبحاث الحمض النووي. كانت هذه التحولات تحسينا مستمرا للتقنية القديمة. يمكن تلخيص هذه التحولات في ثلاثة أجيال1. الجيل الأول هو تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي الذي يعتمد على الرحلان الكهربائي الهلامي لتحديد الأهداف المضخمة واكتشافها. الجيل الثاني هو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qPCR) الذي يمكنه اكتشاف العينات في الوقت الفعلي والاعتماد على منحنى قياسي لتحديد الأهداف مباشرة في العينة. يمكن للجيل الثالث ، PCR الرقمي (dPCR) ، إجراء كل من الكشف والقياس الكمي المطلق لأهداف الحمض النووي دون الحاجة إلى منحنى قياسي. كما تم تحسين dPCR بشكل أكبر من غرف التفاعل التي يتم فصلها بواسطة آبار الجدار إلى مستحلبات من النفط والماء والمواد الكيميائية المستقرة داخل نفس البئر كما هو موضح في تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي2 القائم على القطيرات. في تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي للقطرات (ddPCR) ، يتم تقسيم العينة إلى آلاف القطرات بحجم النانو لتر التي تحتوي على أهداف فردية سيتم تحديدها لاحقا باستخدام إحصائيات بواسون2،3،4. تمنح هذه التقنية ddPCR ميزة في تحديد الأهداف الوفيرة المنخفضة عند مقارنتها بالأجيال الأخرى من تفاعل البوليميراز المتسلسل.
في الآونة الأخيرة ، أبرزت تطبيقات متعددة تفوق ddPCR على qPCR شائع الاستخدام عند اكتشاف وتحديد الأهداف منخفضة الوفرة1،5،6. SARS-CoV-2 ليس استثناء من هذه التطبيقات7،8،9،10،11،12. منذ تفشي SARS-CoV-2 ، يعمل العلماء على جميع الجبهات للتوصل إلى حلول حول كيفية تشخيص الفيروس واكتشافه بكفاءة. لا يزال المعيار الذهبي الحالي هو qPCR13. ومع ذلك ، فقد ثبت أن RT-ddPCR أكثر دقة في الكشف عن أهداف SARS-CoV-2 منخفضة الوفرة من كل من العينات البيئية والسريرية عند مقارنتها ب RT-qPCR7،8،9،10،11،12. تعتمد معظم الأعمال المنشورة ل SARS-CoV-2 ddPCR على المقايسات البسيطة مع المقايسات المتعددة اعتمادا على المقايسات التجارية. ومن ثم ، ينبغي بذل المزيد من الجهد لشرح كيفية تطوير مقايسات RT-dPCR متعددة الإرسال للكشف عن SARS-CoV-2.
في تصميم الفحص المناسب ، يمكن استخدام تعدد الإرسال لتوفير التكلفة ، وزيادة إنتاجية العينة ، وزيادة عدد الأهداف التي يمكن اكتشافها بحساسية داخل عينة صغيرة. عند تعدد الإرسال باستخدام ddPCR ، يجب على المرء أن يأخذ في الاعتبار عدد الفلوروفورات التي يمكن اكتشافها في نظام معين. يمكن لبعض منصات ddPCR دعم ما يصل إلى ثلاث قنوات بينما يدعم البعض الآخر قناتين فقط. ومن ثم ، عند تعدد الإرسال بقناتين ، يتعين على المرء استخدام أساليب مختلفة ، بما في ذلك تعدد الإرسال من أجل أعلى للكشف عن أكثر من هدفين14،15،16. في هذا العمل ، تم استخدام نظام الكشف عن ddPCR بلونين لإظهار خطوات حول كيفية تطوير فحوصات مختلفة ل SARS-CoV-2 RT-ddPCR يمكن تكييفها لتطبيقات بحثية مختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تتوفر موارد قليلة حول كيفية تطوير مقايسات RT-ddPCR للكشف عن SARS-CoV-2. على الرغم من عدم استخدامها في هذه المقالة ، يمكن استخدام العينات القياسية ذات النسخ المعروفة لتطوير المقايسات وتحسينها. ومع ذلك ، في هذا العمل ، تم رفع عينات SARS-CoV-2 المزروعة في خلايا Vero-E6 في خلفية الحمض النووي الريبي الجيني البش…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث من قبل Megaproject of Infectious Disease Control من وزارة الصحة الصينية ، رقم المنحة 2017ZX10302301-005 ومركز الأبحاث الصيني الأفريقي المشترك ، رقم المنحة SAJC201605.
Materials
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
References
- Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world. Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: a technology review. Sensors. 18 (4), 1271 (2018).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236 (1999).
- Kuypers, J., Jerome, K. R. Applications of digital PCR for clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Liu, X., et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).
- Suo, T., et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).
- Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).
- Lv, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR. Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).
- Yu, F., et al. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).
- Scutari, R., et al. Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis. Life. 10 (11), 302 (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection. Preprints. , (2020).
- Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR. Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).
- Dobnik, D., Štebih, D., Blejec, A., Morisset, D., Žel, J. Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection. Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).
- Nyaruaba, R., et al. Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis. Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).
- Lu, R., et al. SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge. medRxiv. , (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing. Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).
