用于SARS-CoV-2检测和定量的两步逆转录液滴数字PCR方案
Summary
这项工作总结了使用双色ddPCR系统开发SARS-CoV-2检测的不同检测方法的步骤。这些步骤很详细，并且已经包括有关如何改进测定和实验性能的说明。这些检测可用于多种SARS-CoV-2 RT-ddPCR应用。
Abstract
诊断正在进行的SARS-CoV-2大流行是全球所有国家的优先事项。目前，逆转录定量PCR（RT-qPCR）是SARS-CoV-2诊断的金标准，因为没有永久的解决方案可用。无论这种技术多么有效，研究表明其在检测和诊断方面的局限性，特别是在涉及低丰度靶标时。相比之下，微滴数字PCR（ddPCR）是一种与qPCR相比具有优越优势的最新新兴技术，已被证明可以克服RT-qPCR在诊断低丰度目标样本SARS-CoV-2方面的挑战。展望未来，在本文中，RT-ddPCR的功能通过展示如何使用双色检测系统开发单工、双链、三链探针混合物和四链体测定的步骤来进一步扩展。使用靶向SARS-CoV-2基因组特定位点（N、ORF1ab、RPP30和RBD2）的引物和探针，这些测定的开发被证明是可能的。此外，还提供了有关如何改进检测工作流程和分析数据的分步详细方案、注释和建议。在未来的工作中调整该工作流程将确保在小样品中灵敏地检测到最大数量的靶标，从而显著降低成本和样品通量。
Introduction
聚合酶链反应（PCR）是一种公认的技术，自问世以来经历了几次转变，成为一种能够为核酸研究提供答案的强大技术。这些转变是对旧技术的不断改进。这些转变可以概括为三代1。第一代是传统的PCR，依靠凝胶电泳来定量和检测扩增的靶标。第二代是实时定量PCR（qPCR），可以实时检测样品，并依靠标准曲线直接量化样品中的靶标。第三代数字PCR（dPCR）可以同时进行核酸靶标的检测和绝对定量，而无需标准曲线。dPCR也得到了进一步改进，从反应室被壁孔分离成油，水和稳定化学品的乳液，在同一孔内看到的，如基于液滴的数字PCR2所示。在液滴数字PCR（ddPCR）中，样品被分成数千个纳升大小的液滴，其中包含单个靶标，稍后将使用泊松统计量2，3，4进行定量。与其他几代PCR相比，该技术使ddPCR在定量低丰度靶标方面具有优势。
最近，多项应用强调了ddPCR在检测和定量低丰度靶标1，5，6时优于常用的qPCR。SARS-CoV-2也不例外7，8，9，10，11，12。自SARS-CoV-2爆发以来，科学家们一直在各个方面开展工作，以提出如何诊断病毒并有效检测病毒的解决方案。目前的黄金标准仍然是qPCR13。然而，与RT-qPCR 7、8、9、10、11、12 相比，RT-ddPCR 在检测环境和临床样本中的低丰度 SARS-CoV-2 靶标方面被证明更准确。大多数SARS-CoV-2 ddPCR发表的工作都依赖于单纯形检测，多重检测则取决于商业检测。因此，应该做更多的工作来解释如何开发用于SARS-CoV-2检测的多重RT-dPCR检测。
在适当的检测设计中，多重检测可用于节省成本，提高样品通量，并最大限度地增加小样品中可灵敏检测的靶标数量。使用ddPCR进行多重检测时，必须考虑在特定系统中可以检测到多少荧光团。一些 ddPCR 平台最多可以支持三个通道，而其他平台仅支持两个通道。因此，当使用两个通道进行多路复用时，必须使用不同的方法，包括高阶多路复用来检测两个以上的目标14，15，16。在这项工作中，使用双色ddPCR检测系统来展示如何开发不同的SARS-CoV-2 RT-ddPCR检测的步骤，这些检测方法可以适应不同的研究应用。
Protocol
Representative Results
Discussion
关于如何开发用于SARS-CoV-2检测的RT-ddPCR检测方法的资源很少。虽然本文未使用，但具有已知拷贝的标准样品可用于开发和优化测定。然而，在这项工作中，在Vero-E6细胞中生长的SARS-CoV-2样品在人类基因组RNA的背景中加标，并用作开发测定的标准样品。在开发检测方法时，正确的引物和探针序列至关重要。由于SARS-CoV-2 RT-ddPCR的大多数初步工作都使用了中国CDC的引物和靶向ORF1ab和N基因的探针，因此他…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究由中国卫生部传染病控制特大项目资助，批准号为2017ZX10302301-005，中非联合研究中心，批准号SAJC201605。
Materials
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
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