Tweestaps omgekeerde transcriptiedruppel digitale PCR-protocollen voor SARS-CoV-2-detectie en kwantificering
Summary
Dit werk vat stappen samen voor het ontwikkelen van verschillende testen voor SARS-CoV-2-detectie met behulp van een tweekleurig ddPCR-systeem. De stappen zijn uitgebreid en er zijn opmerkingen opgenomen over hoe de assays en experimentprestaties kunnen worden verbeterd. Deze testen kunnen worden gebruikt voor meerdere SARS-CoV-2 RT-ddPCR-toepassingen.
Abstract
Diagnose van de aanhoudende SARS-CoV-2-pandemie is een prioriteit voor alle landen over de hele wereld. Momenteel is reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) de gouden standaard voor SARS-CoV-2-diagnose omdat er geen permanente oplossing beschikbaar is. Hoe effectief deze techniek ook is, er is onderzoek naar voren gekomen dat de beperkingen ervan in detectie en diagnose aantoont, vooral als het gaat om lage overvloedige doelen. Daarentegen is aangetoond dat droplet digital PCR (ddPCR), een recente opkomende technologie met superieure voordelen ten opzichte van qPCR, de uitdagingen van RT-qPCR bij de diagnose van SARS-CoV-2 uit laagovervloedige doelmonsters overwint. In dit artikel worden de mogelijkheden van RT-ddPCR verder uitgebreid door stappen te laten zien voor het ontwikkelen van simplex-, duplex-, triplex-sondemix- en quadruplex-assays met behulp van een tweekleurendetectiesysteem. Met behulp van primers en probes gericht op specifieke locaties van het SARS-CoV-2-genoom (N, ORF1ab, RPP30 en RBD2), wordt aangetoond dat de ontwikkeling van deze testen mogelijk is. Daarnaast worden stap voor stap gedetailleerde protocollen, notities en suggesties gegeven over hoe de testworkflow te verbeteren en gegevens te analyseren. Door deze workflow in toekomstige werkzaamheden aan te passen, wordt ervoor gezorgd dat het maximale aantal doelen gevoelig kan worden gedetecteerd in een kleine steekproef, waardoor de kosten en de monsterdoorvoer aanzienlijk worden verbeterd.
Introduction
Polymerasekettingreactie (PCR), een algemeen erkende techniek, heeft sinds zijn komst verschillende transformaties ondergaan om een krachtige techniek te worden die antwoorden kan bieden op nucleïnezuuronderzoek. Deze transformaties zijn een constante verbetering van de oude techniek. Deze transformaties zijn samen te vatten in drie generaties1. De eerste generatie is conventionele PCR die afhankelijk is van gel-elektroforese om versterkte doelen te kwantificeren en te detecteren. De tweede generatie is kwantitatieve real-time PCR (qPCR) die monsters in realtime kan detecteren en vertrouwt op een standaardcurve om doelen in een monster direct te kwantificeren. De derde generatie, digitale PCR (dPCR), kan zowel detectie als absolute kwantificering van nucleïnezuurdoelen uitvoeren zonder dat een standaardcurve nodig is. dPCR is ook verder verbeterd van reactiekamers die worden gescheiden door de putten van een muur in emulsies van olie, water en stabiliserende chemicaliën in dezelfde put als te zien in op druppels gebaseerde digitale PCR2. In droplet digital PCR (ddPCR) wordt een monster verdeeld in duizenden druppels ter grootte van nanoliter met individuele doelen die later zullen worden gekwantificeerd met behulp van Poisson-statistieken 2,3,4. Deze techniek geeft ddPCR een voorsprong bij het kwantificeren van lage abundante doelen in vergelijking met de andere generaties PCR.
Onlangs hebben meerdere toepassingen de superioriteit van ddPCR ten opzichte van de veelgebruikte qPCR benadrukt bij het detecteren en kwantificeren van lage overvloedige doelen 1,5,6. SARS-CoV-2 is geen uitzondering op deze toepassingen 7,8,9,10,11,12. Sinds de uitbraak van SARS-CoV-2 werken wetenschappers op alle fronten aan oplossingen om het virus te diagnosticeren en efficiënt op te sporen. De huidige gouden standaard moet nog steeds qPCR13 zijn. Van RT-ddPCR is echter aangetoond dat het nauwkeuriger is in het detecteren van lage overvloedige SARS-CoV-2-doelen uit zowel omgevings- als klinische monsters in vergelijking met RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. De meeste van de SARS-CoV-2 ddPCR gepubliceerde werken zijn afhankelijk van simplex assays met de multiplex assays afhankelijk van commerciële assays. Daarom moet er meer worden gedaan om uit te leggen hoe multiplex RT-dPCR-assays voor SARS-CoV-2-detectie kunnen worden ontwikkeld.
In een goed testontwerp kan multiplexing worden gebruikt om kosten te besparen, de monsterdoorvoer te verhogen en het aantal doelen te maximaliseren dat gevoelig kan worden gedetecteerd in een klein monster. Bij multiplexing met ddPCR moet men rekening houden met het aantal fluoroforen dat in een bepaald systeem kan worden gedetecteerd. Sommige ddPCR-platforms kunnen maximaal drie kanalen ondersteunen, terwijl andere slechts twee kanalen ondersteunen. Daarom moet men bij multiplexing met twee kanalen verschillende benaderingen gebruiken, waaronder multiplexing van hogere orde om meer dan twee doelente detecteren 14,15,16. In dit werk wordt een tweekleurig ddPCR-detectiesysteem gebruikt om stappen te laten zien voor het ontwikkelen van verschillende SARS-CoV-2 RT-ddPCR-assays die kunnen worden aangepast voor verschillende onderzoekstoepassingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn weinig bronnen beschikbaar over het ontwikkelen van RT-ddPCR-assays voor SARS-CoV-2-detectie. Hoewel niet gebruikt in dit artikel, kunnen standaardmonsters met bekende kopieën worden gebruikt om assays te ontwikkelen en te optimaliseren. In dit werk werden SARS-CoV-2-monsters gekweekt in Vero-E6-cellen echter geprikt in een achtergrond van menselijk genomisch RNA en gebruikt als standaardmonsters om de assays te ontwikkelen. Goede primer- en sondesequenties zijn essentieel bij het ontwikkelen van assays. Aangezi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door Megaproject of Infectious Disease Control van het Ministerie van Volksgezondheid van China, subsidienummer 2017ZX10302301-005 en Sino-Africa Joint Research Center, subsidienummer SAJC201605.
Materials
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
References
- Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world. Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: a technology review. Sensors. 18 (4), 1271 (2018).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236 (1999).
- Kuypers, J., Jerome, K. R. Applications of digital PCR for clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Liu, X., et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).
- Suo, T., et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).
- Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).
- Lv, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR. Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).
- Yu, F., et al. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).
- Scutari, R., et al. Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis. Life. 10 (11), 302 (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection. Preprints. , (2020).
- Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR. Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).
- Dobnik, D., Štebih, D., Blejec, A., Morisset, D., Žel, J. Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection. Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).
- Nyaruaba, R., et al. Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis. Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).
- Lu, R., et al. SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge. medRxiv. , (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing. Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).
