SARS-CoV-2の検出と定量のための2段階逆転写液滴デジタルPCRプロトコル
Summary
この作業では、2色ddPCRシステムを使用したSARS-CoV-2検出のためのさまざまなアッセイを開発する手順を要約しています。手順は精巧であり、アッセイと実験のパフォーマンスを改善する方法に関するメモが含まれています。これらのアッセイは、複数のSARS-CoV-2 RT-ddPCRアプリケーションに使用できます。
Abstract
進行中のSARS-CoV-2パンデミックの診断は、世界中のすべての国にとって優先事項です。現在、逆転写定量PCR(RT-qPCR)は、恒久的な解決策が利用できないため、SARS-CoV-2診断のゴールドスタンダードです。この手法がどれほど効果的であっても、特に存在量の少ないターゲットに関しては、検出と診断の限界を示す研究が浮上しています。対照的に、ドロップレットデジタルPCR(ddPCR)は、qPCRよりも優れた利点を持つ最近の新興技術であり、低量のターゲットサンプルからのSARS-CoV-2の診断におけるRT-qPCRの課題を克服することが示されています。この記事では、2色検出システムを使用してシンプレックス、デュプレックス、トリプレックスプローブミックス、およびクワッドプレックスアッセイを開発する方法の手順を示すことで、RT-ddPCRの機能をさらに拡張します。SARS-CoV-2ゲノムの特定の部位(N、ORF1ab、RPP30、およびRBD2)を標的とするプライマーとプローブを使用して、これらのアッセイの開発が可能であることが示されています。さらに、アッセイワークフローを改善し、データを分析する方法に関する詳細なプロトコル、メモ、および提案を段階的に提供します。このワークフローを将来の作業に適応させることで、小さなサンプルで最大数のターゲットを高感度に検出できるようになり、コストとサンプルスループットが大幅に向上します。
Introduction
よく知られている技術であるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、その登場以来、核酸研究に答えを提供できる強力な技術になるためにいくつかの変革を遂げてきました。これらの変換は、古い手法の絶え間ない改善でした。これらの変換は、3世代に要約できます1。第1世代は、増幅されたターゲットを定量および検出するためにゲル電気泳動に依存する従来のPCRです。第2世代は定量的リアルタイムPCR(qPCR)で、サンプルをリアルタイムで検出し、標準曲線に依存してサンプル中のターゲットを直接定量することができます。第3世代のデジタルPCR(dPCR)は、標準曲線を必要とせずに核酸標的の検出と絶対定量の両方を実行できます。dPCRはまた、液滴ベースのデジタルPCR2に見られるように、壁のウェルによって分離された反応チャンバーから、同じウェル内の油、水、および安定化化学物質のエマルジョンにさらに改善されました。液滴デジタルPCR(ddPCR)では、サンプルは個々のターゲットを含む数千のナノリットルサイズの液滴に分割され、後でポアソン統計2,3,4を使用して定量されます。この手法により、ddPCRは、他の世代のPCRと比較して、存在量の少ないターゲットを定量する上で優位に立つことができます。
最近、複数のアプリケーションが、低存在量のターゲットを検出および定量する際に、一般的に使用されるqPCRに対するddPCRの優位性を強調しています1,5,6。SARS-CoV-2は、これらのアプリケーション7、8、9、10、11、12の例外ではありません。SARS-CoV-2の発生以来、科学者たちはウイルスを診断し、効率的に検出する方法に関する解決策を考え出すためにあらゆる面で取り組んできました。現在のゴールドスタンダードはまだqPCR13です。ただし、RT-ddPCRは、RT-qPCR7、8、9、10、11、12と比較して、環境サンプルと臨床サンプルの両方から低存在量のSARS-CoV-2ターゲットをより正確に検出できることが示されています。SARS-CoV-2 ddPCRで発表された研究のほとんどはシンプレックスアッセイに依存しており、マルチプレックスアッセイは市販のアッセイに依存しています。したがって、SARS-CoV-2検出のためのマルチプレックスRT-dPCRアッセイを開発する方法を説明するために、さらに多くのことを行う必要があります。
適切なアッセイデザインでは、マルチプレックスを使用してコストを節約し、サンプルスループットを向上させ、小さなサンプル内で高感度に検出できるターゲットの数を最大化できます。ddPCRでマルチプレックス化する場合、特定のシステムで検出できる蛍光色素の数を考慮する必要があります。ddPCRプラットフォームには、最大3つのチャネルをサポートできるものもあれば、2つのチャネルのみをサポートするものもあります。したがって、2つのチャネルで多重化する場合、2つ以上のターゲットを検出するための高次多重化を含む異なるアプローチを使用する必要があります14、15、16。この研究では、2色ddPCR検出システムを使用して、さまざまな研究アプリケーションに適応できるさまざまなSARS-CoV-2RT-ddPCRアッセイを開発する方法の手順を示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
SARS-CoV-2検出のためのRT-ddPCRアッセイの開発方法に関するリソースはほとんどありません。この記事では使用しませんが、既知のコピーを含む標準サンプルを使用して、アッセイを開発および最適化できます。ただし、この研究では、Vero-E6細胞で増殖したSARS-CoV-2サンプルをヒトゲノムRNAのバックグラウンドでスパイクし、アッセイを開発するための標準サンプルとして使用しました。適切な?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国保健省の感染症対策メガプロジェクト(助成金番号2017ZX10302301-005)および中アフリカ共同研究センター(助成金番号SAJC201605)から資金提供を受けました。
Materials
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
References
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