Protocolos digitais de PCR digital de gotícula de transcrição reversa em duas etapas para detecção e quantificação de SARS-CoV-2
Summary
Este trabalho resume as etapas no desenvolvimento de ensaios diferentes para a detecção de SARS-CoV-2 usando um sistema ddPCR de duas cores. As etapas são elaboradas e notas foram incluídas sobre como melhorar os ensaios e o desempenho do experimento. Estes ensaios podem ser usados para aplicações SARS-CoV-2 RT-ddPCR.
Abstract
O diagnóstico da pandemia SARS-CoV-2 em curso é uma prioridade para todos os países em todo o mundo. Atualmente, o PCR quantitativo de transcrição reversa (RT-qPCR) é o padrão ouro para o diagnóstico de SARS-CoV-2, pois nenhuma solução permanente está disponível. Por mais eficaz que essa técnica possa ser, pesquisas têm surgido mostrando suas limitações na detecção e diagnóstico, principalmente quando se trata de alvos pouco abundantes. Em contraste, o PCR digital de gotículas (ddPCR), uma tecnologia emergente recente com vantagens superiores sobre o qPCR, mostrou superar os desafios do RT-qPCR no diagnóstico de SARS-CoV-2 a partir de amostras alvo pouco abundantes. Prospectivamente, neste artigo, os recursos do RT-ddPCR são expandidos ainda mais, mostrando etapas sobre como desenvolver ensaios simplex, duplex, triplex probe mix e quadruplex usando um sistema de detecção de duas cores. Usando primers e sondas que visam locais específicos do genoma do SARS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 e RBD2), o desenvolvimento destes ensaios mostra-se possível. Além disso, protocolos detalhados passo a passo, notas e sugestões sobre como melhorar o fluxo de trabalho de ensaios e analisar dados são fornecidos. A adaptação desse fluxo de trabalho em trabalhos futuros garantirá que o número máximo de destinos possa ser detectado de forma sensível em uma pequena amostra, melhorando significativamente o custo e a taxa de transferência da amostra.
Introduction
A reação em cadeia da polimerase (PCR), uma técnica bem reconhecida, passou por diversas transformações desde seu advento para se tornar uma poderosa técnica capaz de fornecer respostas à pesquisa de ácidos nucleicos. Essas transformações têm sido um constante aprimoramento da antiga técnica. Essas transformações podem ser resumidas em três gerações1. A primeira geração é a PCR convencional que se baseia na eletroforese em gel para quantificar e detectar alvos amplificados. A segunda geração é a PCR quantitativa em tempo real (qPCR) que pode detectar amostras em tempo real e contar com uma curva padrão para quantificar diretamente os alvos em uma amostra. A terceira geração, PCR digital (dPCR), pode realizar tanto a detecção quanto a quantificação absoluta de alvos de ácidos nucleicos sem a necessidade de uma curva padrão. A dPCR também foi melhorada a partir de câmaras de reação sendo separadas pelos poços de uma parede em emulsões de óleo, água e produtos químicos estabilizantes dentro do mesmo poço, como visto na PCR digital baseada em gotículas2. Na PCR digital de gotículas (ddPCR), uma amostra é particionada em milhares de gotículas de tamanho nanolitro contendo alvos individuais que serão posteriormente quantificados usando a estatística de Poisson 2,3,4. Esta técnica confere à ddPCR uma vantagem na quantificação de alvos pouco abundantes quando comparada com as outras gerações de PCR.
Recentemente, múltiplas aplicações têm destacado a superioridade da ddPCR sobre a qPCR comumente usada na detecção e quantificação de alvos pouco abundantes 1,5,6. O SARS-CoV-2 não é exceção a essas aplicações 7,8,9,10,11,12. Desde o surto do SARS-CoV-2, os cientistas têm trabalhado em todas as frentes para encontrar soluções sobre como diagnosticar o vírus e detectá-lo de forma eficiente. O padrão-ouro atual ainda continua sendo o qPCR13. No entanto, o RT-ddPCR mostrou-se mais preciso na detecção de alvos SARS-CoV-2 pouco abundantes de amostras ambientais e clínicas quando comparado ao RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. A maioria dos trabalhos publicados sobre o ddPCR SARS-CoV-2 depende de ensaios simplex com os multiplex, dependendo dos ensaios comerciais. Portanto, mais deve ser feito para explicar como desenvolver ensaios multiplex RT-dPCR para detecção de SARS-CoV-2.
Em um projeto de ensaio adequado, a multiplexação pode ser usada para economizar custos, aumentar a taxa de transferência da amostra e maximizar o número de alvos que podem ser detectados sensivelmente em uma pequena amostra. Ao multiplexar com ddPCR, deve-se levar em conta quantos fluoróforos podem ser detectados em um determinado sistema. Algumas plataformas ddPCR podem suportar até três canais, enquanto outras suportam apenas dois canais. Assim, na multiplexação com dois canais, deve-se utilizar diferentes abordagens, incluindo a multiplexação de ordem superior para detectar mais de dois alvos14,15,16. Neste trabalho, um sistema de detecção ddPCR de duas cores é usado para mostrar etapas sobre como desenvolver diferentes ensaios de RT-ddPCR de SARS-CoV-2 que podem ser adaptados para diferentes aplicações de pesquisa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Poucos recursos estão disponíveis sobre como desenvolver ensaios RT-ddPCR para detecção de SARS-CoV-2. Embora não sejam usadas neste artigo, amostras padrão com cópias conhecidas podem ser usadas para desenvolver e otimizar ensaios. Neste trabalho, no entanto, as amostras de SARS-CoV-2 cultivadas em pilhas Vero-E6 foram cravadas em um fundo do RNA genomic humano e usadas como amostras padrão para desenvolver os ensaios. Sequências adequadas de primers e sondas são essenciais no desenvolvimento de ensaios. Uma v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi financiada pelo Megaprojeto de Controle de Doenças Infecciosas do Ministério da Saúde da China, número de concessão 2017ZX10302301-005 e Centro de Pesquisa Conjunta Sino-África, número de concessão SAJC201605.
Materials
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
References
- Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world. Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: a technology review. Sensors. 18 (4), 1271 (2018).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236 (1999).
- Kuypers, J., Jerome, K. R. Applications of digital PCR for clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Liu, X., et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).
- Suo, T., et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).
- Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).
- Lv, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR. Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).
- Yu, F., et al. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).
- Scutari, R., et al. Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis. Life. 10 (11), 302 (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection. Preprints. , (2020).
- Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR. Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).
- Dobnik, D., Štebih, D., Blejec, A., Morisset, D., Žel, J. Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection. Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).
- Nyaruaba, R., et al. Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis. Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).
- Lu, R., et al. SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge. medRxiv. , (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing. Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).
