SARS-CoV-2 Tespiti ve Ölçümü için İki Adımlı Ters Transkripsiyon Damlacığı Dijital PCR Protokolleri
Summary
Bu çalışma, iki renkli bir ddPCR sistemi kullanarak SARS-CoV-2 tespiti için farklı tahliller geliştirme adımlarını özetlemektedir. Adımlar ayrıntılıdır ve tahlillerin ve deney performansının nasıl geliştirileceğine dair notlar eklenmiştir. Bu testler birden fazla SARS-CoV-2 RT-ddPCR uygulaması için kullanılabilir.
Abstract
Devam eden SARS-CoV-2 pandemisinin teşhisi, dünyadaki tüm ülkeler için bir önceliktir. Şu anda, ters transkripsiyon kantitatif PCR (RT-qPCR), kalıcı bir çözüm bulunmadığından SARS-CoV-2 tanısı için altın standarttır. Bu teknik ne kadar etkili olursa olsun, özellikle düşük bol hedefler söz konusu olduğunda, tespit ve tanıdaki sınırlamalarını gösteren araştırmalar ortaya çıkmıştır. Buna karşılık, qPCR’ye göre üstün avantajlara sahip yeni ortaya çıkan bir teknoloji olan damlacık dijital PCR’nin (ddPCR), düşük miktarda hedef numuneden SARS-CoV-2 tanısında RT-qPCR’nin zorluklarının üstesinden geldiği gösterilmiştir. İleriye dönük olarak, bu makalede, RT-ddPCR’nin yetenekleri, iki renkli bir algılama sistemi kullanarak simpleks, dubleks, tripleks prob karışımı ve dörtlü testlerin nasıl geliştirileceğine dair adımlar gösterilerek daha da genişletilmiştir. SARS-CoV-2 genomunun belirli bölgelerini (N, ORF1ab, RPP30 ve RBD2) hedefleyen primerler ve problar kullanılarak, bu testlerin geliştirilmesinin mümkün olduğu gösterilmiştir. Ek olarak, tahlil iş akışının nasıl geliştirileceği ve verilerin nasıl analiz edileceği konusunda adım adım ayrıntılı protokoller, notlar ve öneriler sağlanmaktadır. Bu iş akışının gelecekteki çalışmalara uyarlanması, küçük bir numunede maksimum hedef sayısının hassas bir şekilde tespit edilebilmesini sağlayacak ve maliyet ve numune verimini önemli ölçüde artıracaktır.
Introduction
İyi bilinen bir teknik olan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), nükleik asit araştırmalarına cevap verebilen güçlü bir teknik haline gelmesinden bu yana çeşitli dönüşümler geçirmiştir. Bu dönüşümler eski tekniğin sürekli bir gelişimi olmuştur. Bu dönüşümler üç kuşakta özetlenebilir1. İlk nesil, güçlendirilmiş hedefleri ölçmek ve tespit etmek için jel elektroforezine dayanan geleneksel PCR’dir. İkinci nesil, numuneleri gerçek zamanlı olarak tespit edebilen ve bir numunedeki hedefleri doğrudan ölçmek için standart bir eğriye dayanan kantitatif gerçek zamanlı PCR’dir (qPCR). Üçüncü nesil dijital PCR (dPCR), standart bir eğriye ihtiyaç duymadan nükleik asit hedeflerinin hem tespitini hem de mutlak nicelleştirilmesini gerçekleştirebilir. dPCR ayrıca, bir duvarın kuyuları tarafından ayrılan reaksiyon odalarından, damlacık bazlı dijital PCR2’de görüldüğü gibi, aynı kuyu içinde yağ, su emülsiyonlarına ve stabilize edici kimyasallara daha da geliştirilmiştir. Damlacık dijital PCR’de (ddPCR), bir numune, daha sonra Poisson istatistikleri 2,3,4 kullanılarak ölçülecek olan bireysel hedefleri içeren binlerce nanolitre boyutlu damlacığa bölünür. Bu teknik, ddPCR’ye, diğer PCR nesillerine kıyasla düşük bol hedeflerin ölçülmesinde bir avantaj sağlar.
Son zamanlarda, birden fazla uygulama, düşük bol hedefleri tespit ederken ve ölçerken ddPCR’nin yaygın olarak kullanılan qPCR’ye göre üstünlüğünü vurgulamıştır 1,5,6. SARS-CoV-2 bu uygulamalar için bir istisna değildir 7,8,9,10,11,12. SARS-CoV-2’nin patlak vermesinden bu yana, bilim adamları virüsün nasıl teşhis edileceği ve verimli bir şekilde nasıl tespit edileceği konusunda çözümler bulmak için tüm cephelerde çalışıyorlar. Mevcut altın standart hala qPCR13 olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, RT-ddPCR’nin, RT-qPCR 7,8,9,10,11,12 ile karşılaştırıldığında, hem çevresel hem de klinik örneklerden düşük miktarda SARS-CoV-2 hedeflerini tespit etmede daha doğru olduğu gösterilmiştir. SARS-CoV-2 ddPCR tarafından yayınlanan çalışmaların çoğu, ticari tahlillere bağlı olarak multipleks tahlillere bağlı olarak simpleks tahlillerine dayanmaktadır. Bu nedenle, SARS-CoV-2 tespiti için multipleks RT-dPCR testlerinin nasıl geliştirileceğini açıklamak için daha fazla şey yapılmalıdır.
Uygun bir tahlil tasarımında çoğullama, maliyetten tasarruf etmek, numune verimini artırmak ve küçük bir numune içinde hassas bir şekilde tespit edilebilecek hedef sayısını en üst düzeye çıkarmak için kullanılabilir. ddPCR ile çoğullama yaparken, belirli bir sistemde kaç floroforun tespit edilebileceği dikkate alınmalıdır. Bazı ddPCR platformları en fazla üç kanalı desteklerken, diğerleri yalnızca iki kanalı destekler. Bu nedenle, iki kanalla çoklama yaparken, ikiden fazla hedefi tespit etmek için daha yüksek dereceli çoklama da dahil olmak üzere farklı yaklaşımlar kullanmak gerekir14,15,16. Bu çalışmada, farklı araştırma uygulamaları için uyarlanabilecek farklı SARS-CoV-2 RT-ddPCR testlerinin nasıl geliştirileceğine dair adımları göstermek için iki renkli bir ddPCR tespit sistemi kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
SARS-CoV-2 tespiti için RT-ddPCR testlerinin nasıl geliştirileceği konusunda çok az kaynak mevcuttur. Bu makalede kullanılmamasına rağmen, bilinen kopyaları olan standart numuneler, tahlilleri geliştirmek ve optimize etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu çalışmada, Vero-E6 hücrelerinde yetiştirilen SARS-CoV-2 örnekleri, insan genomik RNA’sının bir arka planında çivilendi ve tahlilleri geliştirmek için standart örnekler olarak kullanıldı. Tahliller geliştirilirken uygun astar ve prob …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Çin Sağlık Bakanlığı’ndan Bulaşıcı Hastalık Kontrolü Mega Projesi, hibe numarası 2017ZX10302301-005 ve Çin-Afrika Ortak Araştırma Merkezi, hibe numarası SAJC201605 tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
References
- Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world. Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: a technology review. Sensors. 18 (4), 1271 (2018).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236 (1999).
- Kuypers, J., Jerome, K. R. Applications of digital PCR for clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Liu, X., et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).
- Suo, T., et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).
- Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).
- Lv, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR. Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).
- Yu, F., et al. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).
- Scutari, R., et al. Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis. Life. 10 (11), 302 (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection. Preprints. , (2020).
- Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR. Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).
- Dobnik, D., Štebih, D., Blejec, A., Morisset, D., Žel, J. Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection. Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).
- Nyaruaba, R., et al. Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis. Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).
- Lu, R., et al. SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge. medRxiv. , (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing. Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).
