患者由来グリオーマ幹細胞を用いたGBMの潜在的併用療法を同定するための迅速スクリーニングワークフロー
Summary
神経膠腫幹細胞(GSC)は、最も流行し、壊滅的な原発性脳腫瘍である神経膠芽腫(GBM)における腫瘍開始、血管新生、薬剤耐性に不可欠な役割を果たす癌細胞のごく一部である。GSCの存在は、GBMを個々の標的剤のほとんどに非常に難治性にするため、潜在的な有効な組み合わせ治療薬を同定するためにハイスループットスクリーニング方法が必要です。プロトコルは、相乗的相互作用と潜在的な併用療法のための迅速なスクリーニングを可能にする簡単なワークフローを記述します。このワークフローの一般的なステップは、ルシメラーゼタグ付きGSCの確立、マトリゲルコーティングされたプレートの調製、併用薬物スクリーニング、分析、および結果の検証を行う。
Abstract
神経膠腫幹細胞(GSC)は、最も流行し、壊滅的な原発性脳腫瘍である神経膠芽腫(GBM)における腫瘍開始、血管新生、薬剤耐性に不可欠な役割を果たす癌細胞のごく一部である。GSCの存在は、GBMを個々の標的剤のほとんどに非常に難治性にするため、潜在的な有効な組み合わせ治療薬を同定するためにハイスループットスクリーニング方法が必要です。プロトコルは、相乗的相互作用と潜在的な併用療法のための迅速なスクリーニングを可能にする簡単なワークフローを記述します。このワークフローの一般的なステップは、ルシメラーゼタグ付きGSCの確立、マトリゲルコーティングされたプレートの調製、併用薬物スクリーニング、分析、および結果の検証を行う。
Introduction
神経膠芽腫(GBM)は、最も一般的で積極的なタイプの原発性脳腫瘍である。現在、最大治療(手術、化学療法、放射線療法の組み合わせ)を受けたGBM患者の全体的な生存期間は、まだ15ヶ月よりも短い。したがって、GBMのための新しく効果的な治療法が緊急に必要です。
GBMにおけるグリオーマ幹細胞(GSC)の存在は、これらのステム様細胞が腫瘍微小環境、薬剤耐性、および腫瘍再発1の維持においてピボット役割を果たすため、従来の治療に対してかなりの課題を構成している。したがって、GSCをターゲットにすることは、GBM治療2の有望な戦略である可能性があります。しかし、GBMにおける薬物有効性の大きな欠点は、遺伝子変異、混合サブタイプ、エピジェネティック調節、腫瘍微小環境の違いを含むがこれらに限定されない異遺伝学的性質であり、治療のために非常に難治性となる。多くの臨床試験に失敗した後、科学者や臨床研究者は、単剤標的療法はおそらくGBMのような非常に異質な癌の進行を完全に制御することができないことに気づいた。一方、慎重に選択された薬物の組み合わせは、互いの効果を相乗的に増強することによってその有効性が承認されており、GBM治療のための有望な解決策を提供する。
CI(組合せ指数)、HSA(最高単一剤)、ブリス値など、薬物の組み合わせの薬物相互作用を評価する方法は多いが、これらの計算方法は通常、複数の濃度の組み合わせに基づいている。実際、これらの方法は、薬物と薬物相互作用の肯定的な評価を提供することができますが、ハイスループットスクリーニングに適用される場合、非常に面倒なことができます。このプロセスを簡素化するために、患者GBMの外科的生検に由来するGSCの成長を阻害する潜在的な薬物組み合わせを迅速に同定するためのスクリーニングワークフローが開発された。各薬剤の相乗効果を定量化するために、期待される組み合わせ効果と観測された組み合わせ効果の差を反映した感度指数(SI)をこの方法に導入し、SIランキングで候補を容易に特定することができます。一方、このプロトコルは、20の小分子阻害剤の中で、GBM治療のための第一線化学療法であるテモゾロミドと抗グリオーマ効果を相乗効果できる潜在的な候補を特定するスクリーンの例を示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、患者由来のGSCを用いたGBMの潜在的な併用療法を同定するために適用できるプロトコルについて説明した。Loewe、BLISS、HSAの方法などの標準的な相乗効果/加算率メトリックモデルとは異なり、従来の方法として完全な要因論的方法で複数の濃度で組み合わせる薬物ペアを必要としないシンプルで迅速なワークフローが使用されました。本ワークフローにおいて、siRNAの感作効果を小…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
中国国立自然科学財団(81672962)、江蘇省イノベーションチームプログラム財団、東南大学と南京医科大学の共同キープロジェクト財団の支援に感謝します。
Materials
| B-27 | Gibco | 17504-044 | 50X |
| EGF | Gibco | PHG0313 | 20 ng/ml |
| FGF | Gibco | PHG0263 | 20 ng/ml |
| Gluta Max | Gibco | 35050061 | 100X |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | 1X |
| Penicillin-Streptomycin | HyClone | SV30010 | P: 10,000 units/ml S: 10,000 ug/ml |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 2088876 | 100 mM |
| Table 1. The formulation of GSC complete culture medium. | |||
| ABT-737 | MCE | Selective and BH3 mimetic Bcl-2, Bcl-xL and Bcl-w inhibitor | |
| Adavosertib (MK-1775) | MCE | Wee1 inhibitor | |
| Axitinib | MCE | Multi-targeted tyrosine kinase inhibitor | |
| AZD5991 | MCE | Mcl-1 inhibitor | |
| A 83-01 | MCE | Potent inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5 kinase | |
| CGP57380 | Selleck | Potent MNK1 inhibitor | |
| Dactolisib (BEZ235) | Selleck | Dual ATP-competitive PI3K and mTOR inhibitor | |
| Dasatinib | MCE | Dual Bcr-Abl and Src family tyrosine kinase inhibitor | |
| Erlotinib | MCE | EGFR tyrosine kinase inhibitor | |
| Gefitinib | MCE | EGFR tyrosine kinase inhibitor | |
| Linifanib | MCE | Multi-target inhibitor of VEGFR and PDGFR family | |
| Masitinib | MCE | Inhibitor of c-Kit | |
| ML141 | Selleck | Non-competitive inhibitor of Cdc42 GTPase | |
| OSI-930 | MCE | Multi-target inhibitor of Kit, KDR and CSF-1R | |
| Palbociclib | MCE | Selective CDK4 and CDK6 inhibitor | |
| SB 202190 | MCE | Selective p38 MAP kinase inhibitor | |
| Sepantronium bromide (YM-155) | MCE | Survivin inhibitor | |
| TCS 359 | Selleck | Potent FLT3 inhibitor | |
| UMI-77 | MCE | Selective Mcl-1 inhibitor | |
| 4-Hydroxytamoxifen(Afimoxifene) | Selleck | Selective estrogen receptor (ER) modulator | |
| Table 2. The information of 20 targeted agents used in the test screen. All of these are target selective small molecular inhibitors. The provider, name, and targets were given in the table. | |||
References
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