تحديد مجموع الدهون والدهون الطبقات في العينات البحرية
Summary
هذا البروتوكول هو لتحديد الدهون في مياه البحر والعينات البيولوجية. يتم استخراج الدهون في الخيوط مع الكلوروفورم أو خليط من الكلوروفورم والميثانول في حالة المواد الصلبة. يتم قياس فئات الدهون بواسطة الكروماتوغرافيا رقيقة الطبقة قضيب مع الكشف عن تأين اللهب ومجموعها يعطي محتوى الدهون الكلي.
Abstract
تتكون الدهون إلى حد كبير من الكربون والهيدروجين ، وبالتالي ، توفر طاقة محددة أكبر من الجزيئات العضوية الأخرى في البحر. وبما أنها غنية بالكربون والهيدروجين، فإنها أيضا كارهة للماء ويمكن أن تعمل كمذيب وحامل امتصاص للملوثات العضوية، وبالتالي يمكن أن تكون محركات للتراكم البيولوجي الملوث في النظم الإيكولوجية البحرية. وتسهل طبيعتها الكارهة للماء عزلها عن مياه البحر أو العينات البيولوجية: يبدأ تحليل الدهون البحرية بأخذ العينات ثم استخراج المذيبات العضوية غير القطبية، مما يوفر طريقة مريحة لفصلها عن المواد الأخرى في مصفوفة مائية.
وإذا تم أخذ عينات من مياه البحر، فإن الخطوة الأولى تنطوي عادة على الانفصال إلى فصائل “مذابة” و”جسيمات” محددة من الناحية التشغيلية عن طريق الترشيح. يتم جمع العينات وعزل الدهون من مصفوفة العينة عادة مع الكلوروفورم للمادة الذائبة حقا والغرويات، ومع خليط من الكلوروفورم والميثانول لالمواد الصلبة والعينات البيولوجية. وقد تحتوي هذه المستخلصات على عدة فئات من مصادر بيولوجية واصطناعية المنشأ. في هذا الوقت، يمكن تحديد مجموع الدهون ودروس الدهون. يمكن قياس مجموع الدهون من خلال تلخيص فئات الدهون المحددة بشكل فردي والتي تم فصلها عادة كروماتوغرافيا. يستخدم كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) مع الكشف عن تأين اللهب (FID) بانتظام للتحليل الكمي للدهون من العينات البحرية. TLC-FID يقدم معلومات فئة الدهون الشاملة، و، من خلال تلخيص الطبقات، وقياس الدهون الكلي.
معلومات فئة الدهون مفيدة بشكل خاص عند دمجها مع قياسات المكونات الفردية مثل الأحماض الدهنية و / أو الستيرولات ، بعد إطلاقها من مقتطفات الدهون. وتعني المجموعة الواسعة من هياكل ووظائف الدهون أنها تستخدم على نطاق واسع في البحوث الإيكولوجية والبيوكيميائية التي تقيم صحة النظم الإيكولوجية ودرجة التأثير الناجم عن الآثار البشرية المنشأ. وقد استخدمت لقياس المواد ذات القيمة الغذائية للحيوانات البحرية (مثل الزوافد المائية و/أو الفريسة)، وكمؤشرات على نوعية المياه (مثل الهيدروكربونات).
Introduction
وتتعلق الأساليب الموصوفة هنا بالمواد التي تعرف من الناحية التشغيلية بأنها دهون بحرية. ويستند هذا التعريف على قابليتها لاستخراج السائل السائل في المذيبات العضوية غير القطبية، ويوفر طريقة مريحة لفصلها عن المواد الأخرى في مصفوفة المائية. وتسهل طبيعتها الكارهة للماء عزلها عن مياه البحر أو العينات البيولوجية، فضلا عن تخصيبها، وإزالة الأملاح والبروتينات.
كان قياس محتوى الدهون وتكوينها في الكائنات البحرية محل اهتمام كبير في إيكولوجيا الشبكة الغذائية، وتغذية الاستزراع المائي، وعلوم الغذاء لعقود. الدهون هي مكونات عالمية في الكائنات الحية ، وتعمل كجزيئات أساسية في أغشية الخلايا ، كمصادر رئيسية للطاقة المتاحة بيولوجيا ، وتوفير العزل الحراري والطفو ، وتعمل كجزيئات إشارة. وعلى الرغم من أن إجراءات تحديد الدهون في المجالات الأخرى قد وصفت وصفا جيدا، فإن استخدامها مع العينات البحرية يستلزم عادة تعديلا للتكيف مع الظروف الميدانية وكذلك للعينة من النوع1.
بالنسبة لعينات مياه البحر، تتطلب الخطوة الأولى عادة الفصل إلى الكسور “المذابة” و”الجسيمية” المحددة من الناحية التشغيلية، عادة عن طريق الترشيح (الخطوة 1 من البروتوكول). الجسيمات كسر ما يتم الاحتفاظ بها من قبل مرشح، وحجم المسام مهم في تحديد قطع2. وفي كثير من الأحيان، عندما نقوم بأخذ عينات من الجسيمات، نود أن نربط تركيزات الدهون بمجموع تركيزات الكتلة، وفي هذه الحالة يجب أخذ عينة منفصلة أصغر حجما (على سبيل المثال، 10 مل) لهذا الغرض (ملاحظة الخطوة 1 من البروتوكول). للحصول على تحديد كتلة دقيقة من المهم إضافة الأمونيوم formate (35 غرام / لتر) في نهاية الترشيح.
وينبغي أن يصل معدل نسبة مياه البحر من العينة الأكبر إلى ما بين 250 مل و1 لتر حسب نوع العينة ويخضع لاستخراج السائل السائل في قمع فاصل (الخطوة 2 من البروتوكول). الطبيعة الكارهة للماء من الدهون يعني أنها يمكن فصلها عن المركبات الأخرى عن طريق استخراج في المذيبات غير القطبية مثل الكلوروفورم. يتم إنشاء نظام من طبقتين حيث تقسم الدهون إلى الطبقة العضوية بينما تبقى المكونات القابلة للذوبان في الماء في الطبقة المائية.
يتم استخراج عينات الجسيمات على مرشح، أو العينات البيولوجية مع تعديل Folch وآخرون استخراج3،التي تنطوي أيضا على الكلوروفورم (البروتوكول الخطوة 3). مرة أخرى ، يتم إنشاء نظام عضوي / مائي حيث تقسم الدهون إلى المرحلة العضوية ، في حين تبقى الجزيئات القابلة للذوبان في الماء في المرحلة المائية ، ويتم التعجيل بالبروتينات. في الواقع، بالنسبة لالمواد الصلبة، تستخدم معظم المختبرات بعض الاختلاف في إجراء Folch et al. extraction3 الذي يتضمن الكلوروفورم والميثانول. بالنسبة للمرشحات، فإن الخطوة الأولى هي التجانس في 2 مل من الكلوروفورم و1 مل من الميثانول.
أثناء الاستخراج ، يجب توخي الحذر لحماية الدهون من التعديل الكيميائي أو الأنزيمي ، عن طريق الاحتفاظ بالعينات والمذيبات على الجليد للحد من التحلل المائي لسندات الاستر أو أكسدة السندات المزدوجة الكربونية الكربونية. الأنسجة والدهون الخلية محمية بشكل جيد جدا من المواد المضادة للاكسدة الطبيعية والتجزيء4; ومع ذلك ، بعد تجانس العينات ، يتم الجمع بين محتويات الخلية مما يجعل الدهون أكثر تخلصا من التغيير ، كيميائيا أو أنزيميا. بعض الدهون، مثل معظم الستيرول، مستقرة جدا، في حين أن البعض الآخر، مثل تلك التي تحتوي على الأحماض الدهنية غير المشبعة، هي أكثر عرضة للأكسدة الكيميائية. البعض الآخر، مثل ستيرول مع السندات المزدوجة المقترنة، عرضة للأكسدة حفزت من قبل ضوء5. بعد عمليات الاستخراج ، تكون الدهون أكثر عرضة للأكسدة الكيميائية ، ويجب تخزين العينات تحت غاز خامل مثل النيتروجين. كما سيتم استخدام تيار لطيف من النيتروجين لتركيز المستخلصات.
وبعد التركيز، عادة ما يتم قياس الدهون بكميات كبيرة لأنها عنصر مهم في النظم الإيكولوجية البحرية التي توفر تركيزا عاليا للطاقة، أي أكثر من ضعف كيلوجول/غرام الكربوهيدرات والبروتينات. ودائما ما يتم قياسها كميا كميا كمكونات فردية: التحليل الشامل للدهون ينطوي عموما على الفصل إلى فئات أبسط، وفقا لطبيعتها الكيميائية. وبالتالي، يتضمن التحليل الكامل قياس مجموع الدهون وفئات الدهون والمركبات الفردية.
يمكن تحديد مجموع الدهون عن طريق أخذ مجموع الطبقات الدهون قياسها بشكل فردي مفصولة كروماتوغرافيا6. قد يحتوي مستخلص الدهون البحري على أكثر من اثنتي عشرة فئة من المصادر البيولوجية والبشرية المنشأ. مجموعة واسعة من الهياكل الدهنية يعني الكثير من المعلومات يمكن الحصول عليها من خلال تحديد التجمعات الفردية للهياكل. وقد استخدمت فئات الدهون بشكل فردي، أو في مجموعات معينة، للإشارة إلى وجود أنواع معينة من الكائنات الحية، فضلا عن حالتها الفسيولوجية والنشاط2. كما استخدمت كمؤشر على أصول المواد العضوية، بما في ذلك المواد العضوية المذابة (DOM) وكذلك الملوثات الكارهة للماء.
Triacylglycerols، فوسفوليبيدات وستيرول هي من بين الطبقات الدهون الحيوية أكثر أهمية. الأولين ترتبط بيوكيميائية لأنها تمتلك العمود الفقري الجلسرين التي يتم استرified اثنين أو ثلاثة من الأحماض الدهنية(الشكل 1). Triacylglycerols، جنبا إلى جنب مع استر الشمع هي مواد تخزين مهمة جدا، في حين أن الطبقات الدهنية الأخرى التي تحتوي على الأحماض الدهنية مثل diacylglycerols، والأحماض الدهنية الحرة، وmonopoacylglycerols هي عموما مكونات طفيفة. الأحماض الدهنية الحرة موجودة بتركيزات أقل في الكائنات الحية، كما يمكن أن تكون تلك غير المشبعة السامة7. يتم تضمين الستيرول (سواء في أشكالها الحرة والمهترة) والكحول الدهنية أيضا من بين الدهون الأقل قطبية ، في حين أن الجليكوليبيدات والفوسفوليبيدات هي دهون قطبية. الدهون القطبية لديها مجموعة هيدروفيلية، والذي يسمح لتشكيل ثنائيات الدهون الموجودة في أغشية الخلايا. الستيرولات الحرة هي أيضا مكونات هيكلية غشاء، وعندما تؤخذ في نسبة إلى triacylglycerols أنها توفر حالة أو مؤشر التغذية (TAG : ST) التي تم استخدامها على نطاق واسع8. عندما تؤخذ في نسبة إلى فوسفوليبيدات (ST : PL) يمكن استخدامها للإشارة إلى حساسية النبات للملح: القيم العالية الحفاظ على السلامة الهيكلية وتقليل نفاذية الغشاء9. وقد درس عكس هذه النسبة (PL : ST) في الأنسجة ثنائية الصمام خلال التكيف مع درجة الحرارة10.
يمكن فصل الطبقات الدهون البحرية من قبل الكروماتوغرافيا رقيقة الطبقة (TLC) على قضبان هلام السيليكا المغلفة (البروتوكول الخطوة 4) ومن ثم الكشف عن وكميا من قبل الكشف عن تأين اللهب (FID) في الماسح الضوئي FID التلقائي. وقد أصبح TLC/FID يستخدم بشكل روتيني للعينات البحرية لأنه يقدم بسرعة بيانات فئة الدهون الشاملة من عينات صغيرة ، ومن خلال أخذ مجموع جميع الطبقات ، وهي قيمة لإجمالي الدهون. وقد خضع TLC/FID لتقييم ضمان الجودة (QA) ووجد أنه يفي بالمعايير المطلوبة للمعايرة الخارجية المتسقة، والفراغات المنخفضة، والتحليل الدقيق للتكرار11. معاملات الاختلاف (CV) أو الانحرافات المعيارية النسبية حوالي 10٪، وFID الماسح الضوئي مجموع بيانات الدهون عادة حوالي 90٪ من تلك التي تم الحصول عليها عن طريق gravimetric وغيرها من الطرق2. يعطي قياس الجاذبية دهون إجمالية أعلى على الأرجح لأن الماسح الضوئي FID يقيس المركبات غير المتطايرة فقط ، وكذلك نتيجة لاحتمال إدراج مواد غير دهون في القياسات المرقمية.
المعلومات التي يقدمها تحليل فئة الدهون مفيدة بشكل خاص عندما يقترن تحديد الأحماض الدهنية كأفراد، أو ستيرول، أو اثنين في تركيبة. الخطوة الأولى نحو هذه التحليلات ينطوي على إطلاق جميع الأحماض الدهنية المكون جنبا إلى جنب مع ستيرولس في مقتطفات الدهون (البروتوكول الخطوة 5). وتعني المجموعة الواسعة من هياكل ووظائف الدهون أنها شهدت استخداما واسعا في الدراسات الإيكولوجية والبيوكيميائية التي تقيم صحة النظم الإيكولوجية ومدى تأثرها بالمدخلات البشرية والأرضية. وقد استخدمت لقياس التركيب البيولوجي للمواد ذات القيمة الغذائية للحيوانات البحرية وكذلك للإشارة إلى نوعية عينات المياه. ويساعد قياس الدهون في العينات الأساسية للرواسب على إظهار حساسية الرواسب للتغيرات في استخدام الإنسان للأراضي بالقرب من هامش البر والبحر.
كانت الأداة الأساسية لتحديد وقياس مركبات الدهون الفردية تقليديا هي كروماتوغرافيا الغاز (GC) مع FID. قبل التحليل ومع ذلك، يتم إجراء هذه المركبات أكثر تقلبا عن طريق الاشتقاق. يتم إطلاق الأحماض الدهنية في وجود محفز حمضي (H2SO4) من فئات الدهون أسيل (الشكل 1). في الكيمياء العضوية، عادة ما تكون مجموعة الأسيل (R-C=O) مشتقة من حمض الكربوكسيليك (R-COOH). ثم يتم إعادة استرجاعها إلى استرات الميثيل الأحماض الدهنية (FAME) الذي يعطي فصل أفضل على أعمدة GC (الخطوة البروتوكول 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
والسرعة التي يوفر بها نظام TLC-FID معلومات فئة الدهون الشاملة من عينات صغيرة تجعل من TLC-FID أداة قادرة على فحص العينات البحرية قبل القيام بإجراءات تحليلية أكثر مشاركة. وتتطلب هذه التحليلات عادة إطلاق مركبات مكونة من مستخلصات الدهون واشتقاقها لزيادة التقلب في حالة الكروماتوغرافيا الغازية. TLC-FID…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث من قبل مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا (NSERC) رقم المنحة 105379 إلى C.C. Parrish. ساعدت شبكة معدات البحوث الأساسية والتدريب على الأجهزة (CREAIT) التابعة لجامعة ميموريال في تمويل هذا المنشور.
Materials
| 15 ml vials | VWR | 66009-560 | |
| 1-hexadecanol | Sigma | 258741-1G | |
| 1-Monopalmitoyl-rac-glycerol | Sigma | M1640-1g | |
| 2 ml vials | VWR | 46610-722 | |
| 25 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32A | |
| 2ml pipet bulbs | VWR | 82024-554 | |
| 47 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32 | |
| 5 3/4" pipets | Fisher | 1367820A | |
| 9" pipets | Fisher | 1367820C | |
| Acetone | VWR | CAAX0116-1 | |
| Agilent GC-FID 6890 | Agilent | ||
| Calcium Chloride ANHS 500gm | VWR | CACX0160-1 | |
| Caps for 2 ml vials | VWR | 46610-712 | |
| chloroform | VWR | CACX1054-1 | |
| Cholesteryl palmitate | Sigma | C6072-1G | |
| Chromarod S5 | Shell USA | 3252 | |
| Dichloromethane | VWR | CADX0831-1 | |
| DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl | Sigma | P5911-1g | |
| Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L | VWR | CAEX0190-4 | |
| Glyceryl tripalmitate | Sigma | T5888-100MG | |
| Hamilton Syringe 702SNR 25µl | Sigma | 58381 | |
| Helium | Air Liquide | A0492781 | |
| Hexane | VWR | CAHX0296-1 | |
| Hydrogen regulator | VWR | 55850-484 | |
| Iatroscan MK6 | Shell USA | ||
| Kimwipes | Fisher | 066662 | |
| Medical Air | Air Liquide | A0464563 | |
| Medium nitrile gloves | Fisher | 191301597C | |
| Nitrile gloves L | VWR | CA82013-782 | |
| Nitrogen | Air Liquide | A0464775 | |
| Nitrogen Regulator | VWR | 55850-474 | |
| Nonadecane | Sigma | 74158-1G | |
| Palmitic acid | Sigma | P0500-10G | |
| Repeating dispenser | Sigma | 20943 | |
| Sodium Bicarbonate 1kg | VWR | CA97062-460 | |
| Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr | VWR | CA71008-804 | |
| Sulfuric acid | VWR | CASX1244-5 | |
| Teflon tape | Fisher | 14610120 | |
| tissue master 125 115V w/7mm homogenator | OMNI International | TM125-115 | |
| TLC development tank | Shell USA | 3201 | |
| UHP hydrogen | Air Liquide | A0492788 | |
| VWR solvent repippetter | VWR | 82017-766 | |
| VWR timer Flashing LED 2 channel | VWR | 89140-196 | |
| Zebron ZB-Wax GC column | Phenomenex | 7HM-G013-11 |
References
- Couturier, L. I. E., et al. State of art and best practices for fatty acid analysis in aquatic sciences. ICES Journal of Marine Science. , (2020).
- Parrish, C. C. Lipids in Marine Ecosystems. ISRN Oceanography. , 604045 (2013).
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
- Vaz, F. M., Pras-Raves, M., Bootsma, A. H., van Kampen, A. H. C. Principles and practice of lipidomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. , (2014).
- Wolf, C., Quinn, P. J. Lipidomics: practical aspects and applications. Progress in Lipid Research. 47, 15-36 (2008).
- Parrish, C. C., Arts, M. T., ainman, B. C. Determination of total lipid, lipid classes, and fatty acids in aquatic samples. Lipids in Freshwater Ecosystems. , 4-20 (1999).
- Jüttner, F. Liberation of 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid and other polyunsaturated fatty acids from lipids as a grazer defense reaction in epilithic diatom biofilms. Journal of Phycology. 37, 744-755 (2001).
- Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Pérez-España, H., Aguiñiga-Garcia, S. Elemental ratios and lipid classes in a coral reef food web under river influence. Progress in Oceanography. 164, 1-11 (2018).
- Maciel, E., et al. Bioprospecting of marine macrophytes using MS-based lipidomics as a new approach. Marine Drugs. 14, 49 (2016).
- Pernet, F., Tremblay, R., Comeau, L., Guderley, H. Temperature adaptation in two bivalve species from different thermal habitats: energetics and remodelling of membrane lipids. Journal of Experimental Biology. 210, 2999-3014 (2007).
- Bergen, B. J., Quinn, J. G., Parrish, C. C. Quality-assurance study of marine lipid-class determination using Chromarod/Iatroscan thin-layer chromatography-flame ionization detector. Environmental Toxicology and Chemistry. 19, 2189-2197 (2000).
- Foroutani, B. M., Parrish, C. C., Wells, J., Taylor, R. G., Rise, M. L. Minimizing marine ingredients in diets of farmed Atlantic salmon (Salmo salar): effects on liver and head kidney lipid class, fatty acid and elemental composition. Fish Physiology & Biochemistry. 46, 2331-2353 (2020).
- Parrish, C. C., Deibel, D., Thompson, R. J. Effect of sinking spring phytoplankton blooms on lipid content and composition in suprabenthic and benthic invertebrates in a cold ocean coastal environment. Marine Ecology Progress Series. 391, 33-51 (2009).
- Sinanoglou, V. J., et al. On the combined application of Iatroscan TLC-FID and GC-FID to identify total, neutral, and polar lipids and their fatty acids extracted from foods. ISRN Chromatography. , 59024 (2013).
- Peters-Didier, J., Sewell, M. A. Maternal investment and nutrient utilization during early larval development of the sea cucumber Australostichopus mollis. Marine Biology. 164, 178 (2017).
- Triesch, N., et al. Concerted measurements of lipids in seawater and on submicron aerosol particles at the Cape Verde Islands: biogenic sources, selective transfer and high enrichments. Atmospheric Chemistry and Physics. 21, 4267-4283 (2021).
- Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Determination of glycoglycerolipids by Chromarod thin-layer chromatography with Iatroscan flame ionization detection. Journal of Chromatography A. 741, 91-97 (1996).
- Mejri, S., et al. Bonefish (Albula vulpes) oocyte lipid class and fatty acid composition related to their development. Environmental Biology of Fishes. 102, 221-232 (2019).
- Sewell, M. A. Utilization of lipids during early development of the sea urchin Evechinus chloroticus. Marine Ecology Progress Series. 304, 133-142 (2005).
- Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Separation of polyunsaturated and saturated lipids from marine phytoplankton on silica gel coated Chromarods. Journal of Chromatography A. 607, 97-104 (1992).
- Stevens, C. J., Deibel, D., Parrish, C. C. Incorporation of bacterial fatty acids and changes in a wax ester-based omnivory index during a long-term incubation experiment with Calanus glacialis Jaschnov. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 303, 135-156 (2004).
- Goutx, M., et al. Short term summer to autumn variability of dissolved lipid classes in the Ligurian Sea (NW Mediterranean). Biogeosciences. 6, 1229-1246 (2009).
- Conlan, J. A., Rocker, M. M., Francis, D. S. A. comparison of two common sample preparation techniques for lipid and fatty acid analysis in three different coral morphotypes reveals quantitative and qualitative differences. PeerJ. 5, 3645 (2017).
