קביעת שיעורי השומנים והשומנים הכוללים בדגימות ימיות
Summary
פרוטוקול זה הוא לקביעת שומנים במי ים ודגימות ביולוגיות. שומנים בסינון מופקים עם כלורופורם או תערובות של כלורופורם ומתנול במקרה של מוצקים. מחלקות השומנים נמדדות על ידי כרומטוגרפיה של שכבה דקה עם זיהוי יינון להבה והסכום שלהם נותן את תכולת השומנים הכוללת.
Abstract
שומנים מורכבים במידה רבה מפחמן ומימן, ולכן מספקים אנרגיה ספציפית גדולה יותר מאשר מקרומולקולות אורגניות אחרות בים. בהיותם עשירים בפחמן ומימן הם גם הידרופוביים ויכולים לשמש כנשא ממסים וספיגה למזהמים אורגניים ולכן יכולים להיות מניעים של ביו-קומקולציה מזהמת במערכות אקולוגיות ימיות. טבעם ההידרופובי מאפשר את בידודם ממי ים או מדגימות ביולוגיות: ניתוח שומנים ימיים מתחיל בדגימה ולאחר מכן מיצוי בממסים אורגניים שאינם קוטביים, ומספק שיטה נוחה להפרדה שלהם מחומרים אחרים במטריצה מימית.
אם נדגמו מי ים, הצעד הראשון כרוך בדרך כלל בהפרדה לפלגים ‘מומסים’ ו’חלקיקיים’ המוגדרים מבצעית על ידי סינון. דגימות נאספות ושומנים מבודדים מטריצת המדגם בדרך כלל עם כלורופורם עבור חומר מומס באמת קולואידים, ועם תערובות של כלורופורם ומתנול עבור מוצקים ודגימות ביולוגיות. תמציות כאלה עשוי להכיל מספר סוגים ממקורות ביוגניים ואנתרופוגניים. בשלב זה, שומנים מוחלטים ושיעורי שומנים עשויים להיקבע. ניתן למדוד את השומנים הכוללים על ידי סיכום מחלקות שומנים בנפרד שנקבעו באופן אינדיבידואלי אשר בדרך כלל הופרדו כרומטוגרפית. כרומטוגרפיה בשכבות דקות (TLC) עם זיהוי יינון להבה (FID) משמשת באופן קבוע לניתוח כמותי של שומנים מדגימות ימיות. TLC-FID מספק מידע מחלקת שומנים סינופטיים, ועל ידי סיכום שיעורים, מדידת שומנים מוחלטת.
מידע מחלקת שומנים הוא שימושי במיוחד בשילוב עם מדידות של רכיבים בודדים למשל, חומצות שומן ו/או סטרולים, לאחר שחרורם מתמציות שומנים. המגוון הרחב של מבנים ותפקודים שומנים פירושו שהם משמשים באופן נרחב במחקר אקולוגי וביוגוכימי הערכת בריאות המערכת האקולוגית ואת מידת ההשפעה על ידי השפעות אנתרופוגניות. הם הועסקו כדי למדוד חומרים בעלי ערך תזונתי לחי ימי (למשל, אקווה-פיד ו/או טרף), וכאינדיקטור לאיכות המים (למשל פחמימנים).
Introduction
השיטות המתוארות כאן נוגעות לחומרים המוגדרים מבצעית כשלומנים ימיים. הגדרה זו מבוססת על נוחותם להפקת נוזל נוזלי בממסים אורגניים שאינם קוטביים, והיא מספקת שיטה נוחה להפרדה שלהם מחומרים אחרים במטריצה מימית. טבעם ההידרופובי מאפשר את בידודם ממי ים או מדגימות ביולוגיות, כמו גם את העשרתם, ואת הסרת המלחים והחלבונים.
מדידת תכולת השומנים והרכבה באורגניזמים ימיים מעניינים מאוד באקולוגיה של רשתות מזון, תזונה בחקלאות ימית ובמדעי המזון במשך עשרות שנים. שומנים הם מרכיבים אוניברסליים באורגניזמים חיים, הפועלים כמולקולות חיוניות בקרומי התא, כמקורות עיקריים לאנרגיה ביולוגית, המספקים בידוד תרמי וציפה, ומשמשים כמולקולות איתות. למרות נהלים לקביעת שומנים בדם בתחומים אחרים תוארו היטב, השימוש שלהם עם דגימות ימיות בדרך כלל מחייב שינוי כדי להתאים לתנאי שדה, כמו גם מדגם סוג1.
עבור דגימות מי ים, הצעד הראשון דורש בדרך כלל הפרדה לתוך השברים המוגדרים מבצעית “מומסים” ו”חלקיקים “, בדרך כלל על ידי סינון (פרוטוקול שלב 1). שבר החלקיקים הוא מה שנשמר על ידי המסנן, וגודל הנקבוביות חשוב בהגדרת החתך2. לעתים קרובות כאשר אנו טועמים חומר חלקיקי, ברצוננו לקשר ריכוזי שומנים לריכוזים המוניים כוללים, ובמקרה זה יש לקחת דגימה נפרדת, קטנה יותר (למשל, 10 מ”ל) למטרה זו (פרוטוקול שלב 1, הערה). כדי לקבל קביעת מסה מדויקת חשוב להוסיף אמוניום formate (35 גרם / ליטר) בסוף הסינון.
מי הים המסונקים מהדגימה הגדולה יותר אמורים להסתכם בין 250 מ”ל ל-1 ליטר בהתאם לסוג המדגם, והוא נתון להפקת נוזלים-נוזליים במשפך נפרד (פרוטוקול שלב 2). הטבע ההידרופובי של שומנים אומר שהם יכולים להיות מופרדים מתרכובות אחרות על ידי מיצוי בממס לא קוטבי כגון כלורופורם. מערכת דו-שכבתית נוצרת כאשר שומנים מתחלקים לשכבה האורגנית בעוד רכיבים מסיסים במים נשארים בשכבה מימית.
דגימות חלקיקים על מסנן, או דגימות ביולוגיות מופקות עם Folch שונה ואח ‘מיצוי3, גם מעורבים כלורופורם (פרוטוקול שלב 3). שוב, נוצרת מערכת אורגנית/מימית שבה שומנים מתחלקים לשלב האורגני, בעוד מולקולות מסיסות במים נשארות בשלב מימי, וחלבונים הם מזודרזים. למעשה, עבור מוצקים, רוב המעבדות להשתמש וריאציה כלשהי של Folch ואח ‘החילוץ3 הליך מעורבים כלורופורם ומתנול. עבור מסננים, הצעד הראשון הוא הומוגניזציה ב 2 מ”ל של כלורופורם ו 1 מ”ל של מתנול.
במהלך החילוץ, יש לנקוט זהירות כדי להגן על שומנים מפני שינוי כימי או אנזימטי, על ידי שמירה על דגימות וממסים על קרח כדי להפחית הידרוליזה קשר אסתר או חמצון קשר כפול פחמן-פחמן. רקמות ושומנים תאים מוגנים היטב על ידי נוגדי חמצון טבעיים ועל ידי מידור4; עם זאת, בעקבות הומוגניזציה של דגימות, תוכן התא משולבים עיבוד שומנים נוטים יותר לשינוי, כימית או אנזימטית. שומנים מסוימים, כגון רוב סטרולים, יציבים מאוד, בעוד שאחרים, כגון אלה המכילים חומצות שומן רב בלתי רוויות, רגישים יותר חמצון כימי. אחרים, כגון סטרולים עם קשרים כפולים מצומדים, נוטים חמצון מזורז על ידי אור5. לאחר עקירות, שומנים רגישים הרבה יותר חמצון כימי, ודגימות צריך להיות מאוחסן תחת גז אינרטי כגון חנקן. זרם עדין של חנקן ישמש גם לרכז תמציות.
לאחר הריכוז, שומנים היו מכמתים בדרך כלל בתפזורת מכיוון שהם מרכיב חשוב במערכות אקולוגיות ימיות המספקות ריכוז גבוה של אנרגיה, יותר מכפליים kJ / g של פחמימות וחלבונים. תמיד הם יהיו כיתבו הבאים כמרכיבים בודדים: ניתוח מקיף של שומנים בדרך כלל כרוך הפרדה לקטגוריות פשוטות יותר, על פי הטבע הכימי שלהם. לכן, ניתוח מלא כרוך במדידת שומנים הכוללים, שיעורי שומנים בדם ותרכובות בודדות.
השומנים הכולל יכול להיקבע על ידי לקיחת הסכום של שיעורי שומנים שנמדדו בנפרד מופרדים על ידי כרומטוגרפיה6. תמצית שומנים ימיים עשויה להכיל יותר מתריסר שיעורים ממקורות ביוגניים ואנתרופוגניים. מגוון רחב של מבני השומנים אומר מידע רב ניתן להשיג על ידי קביעת קבוצות בודדות של מבנים. שיעורי שומנים בנפרד, או בקבוצות מסוימות, שימשו כדי לאותת על נוכחות של סוגים מסוימים של אורגניזמים, כמו גם את מצבם הפיזיולוגי ופעילותם2. הם שימשו גם כאינדיקטור למקורות של חומר אורגני, כולל חומר אורגני מומס (DOM) כמו גם מזהמים הידרופוביים.
טריאציליגליצרולים, פוספוליפידים וסטרולים הם בין שיעורי השומנים הביוגניים החשובים יותר. השניים הראשונים קשורים מבחינה ביוכימית מכיוון שיש להם עמוד שדרה של גליצול שאליו משתיים או שלוש חומצותשומן (איור 1). Triacylglycerols, יחד עם אסטרים שעווה הם חומרי אחסון חשובים מאוד, בעוד שיעורים שומנים המכילים חומצות שומן אחרים כגון diacylglycerols, חומצות שומן חינם, monoacylglycerols הם בדרך כלל מרכיבים משניים. חומצות שומן חופשיות נמצאות בריכוזים נמוכים יותר באורגניזמים חיים, שכן אלה הבלתי רוויים יכולים להיות רעילים7. סטרולים (הן בצורות החופשיות והן באלכוהול שומני) ואלכוהול שומני כלולים גם בין שומנים פחות קוטביים, בעוד גליקולפידים ופוספוליפידים הם שומנים קוטביים. שומנים קוטביים יש קבוצה הידרופילית, המאפשר היווצרות של bilayers שומנים נמצאו בקרומי התא. סטרולים חינם הם גם רכיבים מבניים ממברנה, וכאשר נלקח ביחס triacylglycerols הם מספקים מצב או אינדקס תזונתי (TAG: ST) אשר היה בשימוש נרחב8. כאשר נלקח ביחס פוספוליפידים (ST : PL) הם יכולים לשמש כדי להצביע על רגישות הצמח למלח: ערכים גבוהים יותר לשמור על שלמות מבנית ולהפחית חדירות הממברנה9. ההופכי של יחס זה (PL : ST) נחקר ברקמות דו-שנתיות במהלך התאמתטמפרטורה 10.
מחלקות שומנים ימיות ניתנות להפרדה על ידי כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC) על מוטות מצופים ג’ל סיליקה (פרוטוקול שלב 4) ולאחר מכן זוהו וכימתו על ידי זיהוי יינון להבה (FID) בסורק FID אוטומטי. TLC / FID הפך בשימוש שגרתי עבור דגימות ימיות כפי שהוא מספק במהירות נתונים מחלקת שומנים סינופטיים מדגימות קטנות, ועל ידי לקיחת הסכום של כל הכיתות, ערך עבור שומנים כוללים. TLC/FID עבר הערכת אבטחת איכות (QA) ונמצא כי הוא עומד בתקנים הנדרשים לכיול חיצוני עקבי, ריקים נמוכים וניתוח שכפול מדויק11. מקדמי וריאציה (CV) או סטיות תקן יחסיות הם סביב 10%, וסורק FID סך נתוני השומנים הם בדרך כלל סביב 90% מאלה המתקבלים על ידי gravimetric ושיטות אחרות2. Gravimetry נותן שומנים כוללים גבוהים יותר סביר כי סורק FID מודד רק תרכובות לא נדיפות, וגם כתוצאה של הכללה אפשרית של חומר שאינו שומנים במדידות כבידתיות.
המידע המסופק על ידי ניתוח כיתת השומנים שימושי במיוחד בשילוב עם קביעות של חומצות שומן כיחידים, או סטרולים, או השניים בשילוב. הצעד הראשון לקראת ניתוחים אלה כרוך שחרור של כל חומצות שומן רכיב יחד עם סטרולים בתמציות השומנים (פרוטוקול שלב 5). המגוון הרחב של מבנים שומנים ותפקודים אומר שהם ראו שימוש נרחב במחקרים אקולוגיים וביוגיאוכימיים הערכת בריאות המערכת האקולוגית ואת המידה שבה הם הושפעו על ידי תשומות אנתרופוגניות ויבשתיות. הם שימשו למדידת biosynthesis של חומרים בעלי ערך תזונתי לחיות ימיות, כמו גם כדי לציין את איכות דגימות מים. מדידת שומנים בדגימות ליבת משקעים מסייעת להראות את הרגישות של משקעים לשינויים בשימוש בקרקע האנושית ליד השוליים היבשתיים-ימיים.
הכלי העיקרי לזיהוי וכימות תרכובות שומנים בודדות היה באופן מסורתי כרומטוגרפיה גז (GC) עם FID. לפני הניתוח עם זאת, תרכובות אלה נעשים תנודתיים יותר על ידי derivatization. חומצות שומן משתחררות בנוכחות זרז חומצי (H2SO4)משיעורי סיל שומנים בדם(איור 1). בכימיה אורגנית, קבוצת האציל (R-C=O) מופקת בדרך כלל מחומצה קרבוקסילית (R-COOH). לאחר מכן הם מחדש אסטרים מתיל חומצת שומן (FAME) אשר נותן הפרדות טובות יותר על עמודות GC (פרוטוקול שלב 5).
Protocol
Representative Results
Discussion
המהירות שבה מערכת TLC-FID מספקת מידע מחלקת שומנים סינופטיים מדגימות קטנות הופכת את TLC-FID לכלי מסוגל לבדיקת דגימות ימיות לפני ביצוע הליכים אנליטיים מעורבים יותר. ניתוחים כאלה דורשים בדרך כלל שחרור של תרכובות רכיבים מתמציות שומנים ונגזרות כדי להגביר את התנודתיות במקרה של כרומטוגרפיה גז. TLC-FID ב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי המועצה למדעי הטבע ומחקר ההנדסה של קנדה (NSERC) מענק מספר 105379 ל- C.C. Parrish. רשת ציוד המחקר והכשרת הכלים המרכזיים של אוניברסיטת ממוריאל (CREAIT) סייעה לממן פרסום זה.
Materials
| 15 ml vials | VWR | 66009-560 | |
| 1-hexadecanol | Sigma | 258741-1G | |
| 1-Monopalmitoyl-rac-glycerol | Sigma | M1640-1g | |
| 2 ml vials | VWR | 46610-722 | |
| 25 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32A | |
| 2ml pipet bulbs | VWR | 82024-554 | |
| 47 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32 | |
| 5 3/4" pipets | Fisher | 1367820A | |
| 9" pipets | Fisher | 1367820C | |
| Acetone | VWR | CAAX0116-1 | |
| Agilent GC-FID 6890 | Agilent | ||
| Calcium Chloride ANHS 500gm | VWR | CACX0160-1 | |
| Caps for 2 ml vials | VWR | 46610-712 | |
| chloroform | VWR | CACX1054-1 | |
| Cholesteryl palmitate | Sigma | C6072-1G | |
| Chromarod S5 | Shell USA | 3252 | |
| Dichloromethane | VWR | CADX0831-1 | |
| DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl | Sigma | P5911-1g | |
| Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L | VWR | CAEX0190-4 | |
| Glyceryl tripalmitate | Sigma | T5888-100MG | |
| Hamilton Syringe 702SNR 25µl | Sigma | 58381 | |
| Helium | Air Liquide | A0492781 | |
| Hexane | VWR | CAHX0296-1 | |
| Hydrogen regulator | VWR | 55850-484 | |
| Iatroscan MK6 | Shell USA | ||
| Kimwipes | Fisher | 066662 | |
| Medical Air | Air Liquide | A0464563 | |
| Medium nitrile gloves | Fisher | 191301597C | |
| Nitrile gloves L | VWR | CA82013-782 | |
| Nitrogen | Air Liquide | A0464775 | |
| Nitrogen Regulator | VWR | 55850-474 | |
| Nonadecane | Sigma | 74158-1G | |
| Palmitic acid | Sigma | P0500-10G | |
| Repeating dispenser | Sigma | 20943 | |
| Sodium Bicarbonate 1kg | VWR | CA97062-460 | |
| Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr | VWR | CA71008-804 | |
| Sulfuric acid | VWR | CASX1244-5 | |
| Teflon tape | Fisher | 14610120 | |
| tissue master 125 115V w/7mm homogenator | OMNI International | TM125-115 | |
| TLC development tank | Shell USA | 3201 | |
| UHP hydrogen | Air Liquide | A0492788 | |
| VWR solvent repippetter | VWR | 82017-766 | |
| VWR timer Flashing LED 2 channel | VWR | 89140-196 | |
| Zebron ZB-Wax GC column | Phenomenex | 7HM-G013-11 |
References
- Couturier, L. I. E., et al. State of art and best practices for fatty acid analysis in aquatic sciences. ICES Journal of Marine Science. , (2020).
- Parrish, C. C. Lipids in Marine Ecosystems. ISRN Oceanography. , 604045 (2013).
- Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
- Vaz, F. M., Pras-Raves, M., Bootsma, A. H., van Kampen, A. H. C. Principles and practice of lipidomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. , (2014).
- Wolf, C., Quinn, P. J. Lipidomics: practical aspects and applications. Progress in Lipid Research. 47, 15-36 (2008).
- Parrish, C. C., Arts, M. T., ainman, B. C. Determination of total lipid, lipid classes, and fatty acids in aquatic samples. Lipids in Freshwater Ecosystems. , 4-20 (1999).
- Jüttner, F. Liberation of 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid and other polyunsaturated fatty acids from lipids as a grazer defense reaction in epilithic diatom biofilms. Journal of Phycology. 37, 744-755 (2001).
- Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Pérez-España, H., Aguiñiga-Garcia, S. Elemental ratios and lipid classes in a coral reef food web under river influence. Progress in Oceanography. 164, 1-11 (2018).
- Maciel, E., et al. Bioprospecting of marine macrophytes using MS-based lipidomics as a new approach. Marine Drugs. 14, 49 (2016).
- Pernet, F., Tremblay, R., Comeau, L., Guderley, H. Temperature adaptation in two bivalve species from different thermal habitats: energetics and remodelling of membrane lipids. Journal of Experimental Biology. 210, 2999-3014 (2007).
- Bergen, B. J., Quinn, J. G., Parrish, C. C. Quality-assurance study of marine lipid-class determination using Chromarod/Iatroscan thin-layer chromatography-flame ionization detector. Environmental Toxicology and Chemistry. 19, 2189-2197 (2000).
- Foroutani, B. M., Parrish, C. C., Wells, J., Taylor, R. G., Rise, M. L. Minimizing marine ingredients in diets of farmed Atlantic salmon (Salmo salar): effects on liver and head kidney lipid class, fatty acid and elemental composition. Fish Physiology & Biochemistry. 46, 2331-2353 (2020).
- Parrish, C. C., Deibel, D., Thompson, R. J. Effect of sinking spring phytoplankton blooms on lipid content and composition in suprabenthic and benthic invertebrates in a cold ocean coastal environment. Marine Ecology Progress Series. 391, 33-51 (2009).
- Sinanoglou, V. J., et al. On the combined application of Iatroscan TLC-FID and GC-FID to identify total, neutral, and polar lipids and their fatty acids extracted from foods. ISRN Chromatography. , 59024 (2013).
- Peters-Didier, J., Sewell, M. A. Maternal investment and nutrient utilization during early larval development of the sea cucumber Australostichopus mollis. Marine Biology. 164, 178 (2017).
- Triesch, N., et al. Concerted measurements of lipids in seawater and on submicron aerosol particles at the Cape Verde Islands: biogenic sources, selective transfer and high enrichments. Atmospheric Chemistry and Physics. 21, 4267-4283 (2021).
- Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Determination of glycoglycerolipids by Chromarod thin-layer chromatography with Iatroscan flame ionization detection. Journal of Chromatography A. 741, 91-97 (1996).
- Mejri, S., et al. Bonefish (Albula vulpes) oocyte lipid class and fatty acid composition related to their development. Environmental Biology of Fishes. 102, 221-232 (2019).
- Sewell, M. A. Utilization of lipids during early development of the sea urchin Evechinus chloroticus. Marine Ecology Progress Series. 304, 133-142 (2005).
- Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Separation of polyunsaturated and saturated lipids from marine phytoplankton on silica gel coated Chromarods. Journal of Chromatography A. 607, 97-104 (1992).
- Stevens, C. J., Deibel, D., Parrish, C. C. Incorporation of bacterial fatty acids and changes in a wax ester-based omnivory index during a long-term incubation experiment with Calanus glacialis Jaschnov. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 303, 135-156 (2004).
- Goutx, M., et al. Short term summer to autumn variability of dissolved lipid classes in the Ligurian Sea (NW Mediterranean). Biogeosciences. 6, 1229-1246 (2009).
- Conlan, J. A., Rocker, M. M., Francis, D. S. A. comparison of two common sample preparation techniques for lipid and fatty acid analysis in three different coral morphotypes reveals quantitative and qualitative differences. PeerJ. 5, 3645 (2017).
