Disección de las propiedades mecanoenzimáticas de miosinas procesivas con espectroscopia ultrarrápida de pinza de fuerza
Summary
Aquí se presenta un protocolo integral para realizar experimentos ultrarrápidos de abrazadera de fuerza en motores de miosina-5 procesuales, que podrían extenderse fácilmente al estudio de otras clases de motores de proceso. El protocolo detalla todos los pasos necesarios, desde la configuración del aparato experimental hasta la preparación de muestras, la adquisición de datos y el análisis.
Abstract
La espectroscopia ultrarrápida de pinza de fuerza (UFFCS) es una técnica de molécula única basada en pinzas láser que permite la investigación de la quimiomecánica de miosinas convencionales y no convencionales bajo carga con una resolución de tiempo sin precedentes. En particular, la posibilidad de sondear motores de miosina bajo fuerza constante justo después de la formación del enlace actina-miosina, junto con la alta tasa de retroalimentación de fuerza (200 kHz), ha demostrado que UFFCS es una herramienta valiosa para estudiar la dependencia de la carga de dinámicas rápidas como la carrera de trabajo de la miosina. Además, UFFCS permite el estudio de cómo las interacciones miosina-actina procesivas y no procesivas están influenciadas por la intensidad y la dirección de la fuerza aplicada.
Siguiendo este protocolo, será posible realizar experimentos ultrarrápidos de fuerza-pinza en motores de miosina 5 procesiva y en una variedad de miosinas no convencionales. Mediante algunos ajustes, el protocolo también podría extenderse fácilmente al estudio de otras clases de motores de proceso como quinesinas y dineínas. El protocolo incluye todos los pasos necesarios, desde la configuración del aparato experimental hasta la preparación de muestras, procedimientos de calibración, adquisición de datos y análisis.
Introduction
En las últimas décadas, las pinzas ópticas han sido una herramienta valiosa para dilucidar la mecanoquímica de las interacciones de proteínas a nivel de molécula única, debido a la sorprendente posibilidad de manipulación concurrente y medición de cambios conformacionales y cinética enzimática 1,2. En particular, la capacidad de aplicar y medir fuerzas en el rango de las ejercidas por los motores moleculares en la célula, junto con la capacidad de medir cambios conformacionales subnanométricos, hicieron de las pinzas ópticas una herramienta única de una sola molécula para desentrañar las propiedades quimiomecánicas de las proteínas motoras y su regulación mecánica.
La espectroscopia ultrarrápida de pinza de fuerza (UFFCS) es una técnica de espectroscopia de fuerza de molécula única basada en pinzas ópticas, desarrollada para estudiar la cinética rápida de motores moleculares bajo carga en una geometría de tres perlas (Figura 1a)3,4. UFFCS reduce el tiempo de aplicación de fuerza a la proteína motora hasta el límite físico de las pinzas ópticas, es decir, el tiempo de relajación mecánica del sistema, permitiendo así la aplicación de la fuerza rápidamente después del comienzo de una carrera de miosina (pocas decenas de microsegundos)3. Esta capacidad se ha explotado para investigar los eventos mecánicos tempranos en la miosina del músculo esquelético 3 rápido y elmúsculo 5 cardíaco para revelar la dependencia de la carga de la carrera de potencia, los estados de unión débil y fuerte, así como el orden de los eventos bioquímicos (Pi) y mecánicos (carrera de potencia).
La geometría de tres perlas se emplea generalmente para estudiar motores no procesivos, una geometría de una sola perla con una abrazadera de fuerza se ha utilizado comúnmente para investigar miosinas procesivas no convencionales como la miosina Va6. Sin embargo, hay varias razones para preferir un ensayo UFFCS de tres perlas también para miosinas procesivas. En primer lugar, la rápida aplicación de la carga justo después de la unión actina-miosina permite la medición de los primeros eventos en el desarrollo de la fuerza como en los motores no procesivos. Además, en el caso de los motores de proceso, también permite una medición precisa de las longitudes de funcionamiento del motor y las duraciones de funcionamiento bajo fuerza constante a lo largo de su progresión (Figura 1b). Además, debido a la alta tasa de retroalimentación de fuerza, el sistema puede mantener la fuerza constante durante los cambios rápidos de posición, como la carrera de trabajo de la miosina, garantizando así una carga constante durante el paso del motor. La alta resolución temporal del sistema permite la detección de interacciones sub-ms, abriendo la posibilidad de investigar la unión débil de la miosina a la actina. Finalmente, la geometría del ensayo garantiza que la fuerza se aplique a lo largo del filamento de actina, con componentes transversales y verticales insignificantes de la fuerza. Este punto es de particular relevancia ya que se ha demostrado que el componente de fuerza vertical influye significativamente en la dependencia de la carga de la cinética del motor 7,8. Mediante el uso de esta técnica, podríamos aplicar un rango de cargas asistenciales y resistivas a la miosina-5B procesiva y medir directamente la dependencia de la carga de su procesividad para un amplio rango de fuerzas4.
Como se muestra en la Figura 1a, en este sistema un solo filamento de actina está suspendido entre dos perlas de poliestireno atrapadas en el foco de pinzas ópticas dobles (la “mancuerna”). Una fuerza neta desequilibrada F = F1-F 2 se impone sobre el filamento, a través de un sistema de retroalimentación rápida, que hace que el filamento se mueva a velocidad constante en una dirección hasta que alcanza un punto de inversión definido por el usuario donde la fuerza neta se invierte en la dirección opuesta. Cuando la proteína motora no está interactuando con el filamento, la mancuerna es libre de moverse hacia adelante y hacia atrás en forma de onda triangular (Figura 1b, panel inferior) que abarca el cordón del pedestal en el que se une una sola proteína motora. Una vez que se establece la interacción, la fuerza transportada por la mancuerna se transfiere muy rápidamente a la proteína motora y el motor comienza a desplazar el filamento al paso por debajo de la intensidad de fuerza y la dirección que aplicó el sistema de retroalimentación en el momento de la interacción, hasta que la miosina se separa de la actina. Dado que el desplazamiento producido por el paso del motor depende de la polaridad del filamento de actina atrapado, según la dirección de la fuerza aplicada, la carga puede ser asistencial, es decir, empujando en la misma dirección del desplazamiento del motor (empuje en el panel superior de la Figura 1b), o resistiva, es decir, tirando en la dirección opuesta con respecto al desplazamiento del motor (tire en la Figura 1b panel superior) que permite estudiar la regulación quimiomecánica de la procesividad del motor tanto por la intensidad como por la direccionalidad de la carga aplicada.
En las siguientes secciones se describen completamente todos los pasos para medir las interacciones actina-miosina-5B bajo diferentes cargas con una configuración de espectroscopia de fuerza-abrazadera ultrarrápida, incluyendo 1) la configuración de la configuración óptica, la alineación de trampas ópticas y los procedimientos de calibración, 2) las preparaciones de todos los componentes y su ensamblaje en la cámara de muestra, 3) el procedimiento de medición, 4) Datos representativos y análisis de datos para extraer parámetros físicos importantes, como la longitud de la carrera, el tamaño del paso y la velocidad de la proteína motora.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque las técnicas de molécula única, como el ensayo de tres perlas, son técnicamente desafiantes y de bajo rendimiento, UFFCS mejora la detección de interacciones moleculares gracias a la alta relación señal-ruido de los datos. UFFCS permite el estudio de la dependencia de la carga de las proteínas motoras, con las principales ventajas de aplicar la fuerza muy rápidamente al unirse el motor al filamento para sondear eventos tempranos y muy rápidos en la producción de fuerza y estados de unión débiles bajo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el Acuerdo de Subvención No. 871124 Laserlab-Europe, por el Ministerio de Universidad e Investigación de Italia (FIRB “Futuro in Ricerca” 2013 Grant No. RBFR13V4M2), y por Ente Cassa di Risparmio di Firenze. A.V. Kashchuk recibió el apoyo de la beca interdisciplinaria LT008/2020-C del Programa de Ciencias de la Frontera Humana.
Materials
| Aliphatic Amine Latex Beads | ThermoFisher | A37362 | 1.0-μm diameter, 2% (w/v) |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Actin polymerization buffer | Cytoskeleton | BSA02 | 10X |
| AODs (acousto-optic deflectors) | AA Opto Electronic | DTS-XY 250 | Laser beam deflectors |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Biotinylated-BSA | ThermoFisher | 29130 | |
| BSA | Sigma | B4287 | |
| Calmodulin from porcine brain (CaM) | Merck Millipore | 208783 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C40 | |
| Condenser | Olympus | OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat | NA 1.4, oil immersion |
| Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate | Sigma | 27920 | |
| Creatine Phosphokinase from rabbit muscle | Sigma | C3755 | |
| DDs | AA Opto Electronic | AA.DDS.XX | Two-channel digital synthesizer |
| DL-Dithiothreitol (DTT)/td> | Sigma | 43819 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| G-actin protein | Cytoskeleton | AKL99 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger | Sigma | G7141 | |
| HaloTag succinimidyl ester O2 ligand | Promega | P1691 | |
| High vacuum silicone grease heavy | Merck Millipore | 107921 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| KH2PO4/K2HPO4 | Sigma | P5379/ P8281 | |
| Labview | National Instruments | version 8.1 | Data acquisition |
| Labview FPGA module | National Instruments | version 8.1 | Fast Force-Clamp |
| Matlab | MathWorks | 2016 | Data analysis |
| MgCl2 | Fluka | 63020 | |
| Microscope Objective | Nikon | Plan-Apo 60X | NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm. |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| Nitrocellulose | Sigma | N8267 | 0.45 pore size |
| Pentyl acetate solution | Sigma | 46022 | |
| Pure Ethanol | Sigma | 2860 | |
| QPDs | UDT | DLS-20 | D Position Detecto |
| Rhodamine BSA | Molecular Probes | A23016 | |
| Rhodamine Phalloidin | Sigma | P1951 | |
| Silica beads | Bangslabs | SS04N | 1.21 mm, 10% solids |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Streptavidin protein | Sigma | 189730 |
References
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