تشريح الخصائص الميكانيكية الأنزيمية للميوسينات العملية باستخدام التحليل الطيفي فائق السرعة لقوة المشبك
Summary
يظهر هنا بروتوكول شامل لإجراء تجارب مشبك قوة فائقة السرعة على محركات الميوسين -5 المعالجة ، والتي يمكن تمديدها بسهولة لدراسة فئات أخرى من المحركات العملية. يفصل البروتوكول جميع الخطوات اللازمة ، من إعداد الجهاز التجريبي إلى إعداد العينات والحصول على البيانات وتحليلها.
Abstract
التحليل الطيفي فائق السرعة بمشبك القوة (UFFCS) هو تقنية جزيء واحد تعتمد على ملاقط الليزر التي تسمح بالتحقيق في الميكانيكا الكيميائية لكل من الميوسين التقليدي وغير التقليدي تحت الحمل بدقة زمنية غير مسبوقة. على وجه الخصوص ، أظهرت إمكانية فحص محركات الميوسين تحت قوة ثابتة مباشرة بعد تكوين رابطة الأكتين والميوسين ، جنبا إلى جنب مع المعدل المرتفع لردود الفعل للقوة (200 كيلو هرتز) ، أن UFFCS أداة قيمة لدراسة الاعتماد على الحمل للديناميكيات السريعة مثل شوط عمل الميوسين. علاوة على ذلك ، يتيح UFFCS دراسة كيفية تأثر تفاعلات الميوسين والأكتين الإجرائية وغير العملية بكثافة واتجاه القوة المطبقة.
باتباع هذا البروتوكول ، سيكون من الممكن إجراء تجارب فائقة السرعة على محركات الميوسين -5 المعالجة وعلى مجموعة متنوعة من الميوسينات غير التقليدية. من خلال بعض التعديلات ، يمكن أيضا توسيع البروتوكول بسهولة لدراسة فئات أخرى من المحركات المعالجة مثل kinesins و dyneins. يتضمن البروتوكول جميع الخطوات اللازمة ، من إعداد الجهاز التجريبي إلى إعداد العينات وإجراءات المعايرة والحصول على البيانات وتحليلها.
Introduction
في العقود الأخيرة ، كانت الملقط البصري أداة قيمة لتوضيح الكيمياء الميكانيكية لتفاعلات البروتين على مستوى الجزيء الواحد ، نظرا للإمكانية المذهلة للتلاعب المتزامن وقياس التغيرات التوافقية والحركية الأنزيمية 1,2. على وجه الخصوص ، فإن القدرة على تطبيق وقياس القوى في نطاق تلك التي تمارسها المحركات الجزيئية في الخلية ، جنبا إلى جنب مع القدرة على قياس التغيرات التوافقية دون النانومتر ، جعلت الملقط البصري أداة فريدة من نوعها أحادية الجزيء لكشف الخواص الميكانيكية الكيميائية للبروتينات الحركية وتنظيمها الميكانيكي.
التحليل الطيفي فائق السرعة (UFFCS) هو تقنية التحليل الطيفي للقوة أحادية الجزيء تعتمد على ملاقط بصرية ، تم تطويرها لدراسة الحركية السريعة للمحركات الجزيئية تحت الحمل في هندسة ثلاثية الخرز (الشكل 1 أ) 3,4. يقلل UFFCS من الفارق الزمني لتطبيق القوة على البروتين الحركي إلى الحد المادي للملاقط الضوئية ، أي وقت الاسترخاء الميكانيكي للنظام ، مما يسمح بتطبيق القوة بسرعة بعد بداية تشغيل الميوسين (بضع عشرات من الميكروثانية)3. تم استغلال هذه القدرة للتحقيق في الأحداث الميكانيكية المبكرة في الميوسين العضلي الهيكلي السريع 3 والقلب5 للكشف عن الاعتماد على الحمل لضربة القوة ، وحالات الربط الضعيفة والقوية ، بالإضافة إلى ترتيب الأحداث البيوكيميائية (Pi) والميكانيكية (powerstroke).
عادة ما يتم استخدام هندسة الخرز الثلاثة لدراسة المحركات غير المعالجة ، وقد تم استخدام هندسة حبة واحدة مع مشبك قوة بشكل شائع للتحقيق في الميوسين غير التقليدي مثل الميوسين Va6. ومع ذلك ، هناك عدة أسباب لتفضيل مقايسة UFFCS ثلاثية الخرزات أيضا للميوسينات العملية. أولا ، يسمح التطبيق السريع للحمل مباشرة بعد ربط الأكتين-الميوسين بقياس الأحداث المبكرة في تطور القوة كما هو الحال في المحركات غير المعالجة. بالإضافة إلى ذلك ، في حالة المحركات المعالجة ، فإنه يسمح أيضا بقياس دقيق لأطوال تشغيل المحرك وفترات التشغيل تحت قوة ثابتة طوال تقدمها (الشكل 1 ب). علاوة على ذلك ، نظرا لارتفاع معدل ردود الفعل للقوة ، يمكن للنظام الحفاظ على ثبات القوة أثناء التغييرات السريعة في الموضع ، مثل شوط عمل الميوسين ، وبالتالي ضمان حمل ثابت أثناء خطوة المحرك. تسمح الدقة الزمنية العالية للنظام باكتشاف التفاعلات الفرعية ، مما يفتح إمكانية التحقيق في الارتباط الضعيف للميوسين بالأكتين. أخيرا ، تضمن هندسة الفحص تطبيق القوة على طول خيوط الأكتين ، مع مكونات عرضية ورأسية لا تذكر للقوة. هذه النقطة ذات أهمية خاصة حيث ثبت أن مكون القوة الرأسية يؤثر بشكل كبير على اعتماد الحمل لحركية المحرك 7,8. باستخدام هذه التقنية ، يمكننا تطبيق مجموعة من الأحمال المساعدة والمقاومة على الميوسين 5B المعالج وقياس اعتماد الحمل لعمليته مباشرة لمجموعة واسعة من القوى4.
كما هو موضح في الشكل 1 أ ، في هذا النظام ، يتم تعليق خيوط أكتين واحدة بين حبتين من البوليسترين محبوستين في بؤرة ملاقط بصرية مزدوجة (“الدمبل”). يتم فرض قوة صافية غير متوازنة F = F1-F 2 على الفتيل ، من خلال نظام تغذية مرتدة سريعة ، مما يجعل الفتيل يتحرك بسرعة ثابتة في اتجاه واحد حتى يصل إلى نقطة انعكاس يحددها المستخدم حيث يتم عكس القوة الكلية في الاتجاه المعاكس. عندما لا يتفاعل البروتين الحركي مع الفتيل ، يكون الدمبل حرا في التحرك ذهابا وإيابا في شكل موجة مثلثة (الشكل 1 ب ، اللوحة السفلية) تمتد على حبة القاعدة التي يرتبط بها بروتين محرك واحد. بمجرد إنشاء التفاعل ، يتم نقل القوة التي يحملها الدمبل بسرعة كبيرة إلى البروتين الحركي ويبدأ المحرك في إزاحة الفتيل عن طريق الدوس تحت شدة القوة والاتجاه الذي تم تطبيقه بواسطة نظام التغذية المرتدة في وقت التفاعل ، حتى ينفصل الميوسين عن الأكتين. نظرا لأن الإزاحة الناتجة عن خطوة المحرك تعتمد على قطبية خيوط الأكتين المحاصرة ، وفقا لاتجاه القوة المطبقة ، يمكن أن يكون الحمل إما مساعدا ، أي الدفع في نفس اتجاه إزاحة المحرك (الدفع في اللوحة العلوية الشكل 1 ب) ، أو مقاوما ، أي السحب في الاتجاه المعاكس فيما يتعلق بإزاحة المحرك (السحب في الشكل 1 ب اللوحة العلوية) مما يجعل من الممكن دراسة التنظيم الكيميائي الميكانيكي للعملية الحركية من خلال كل من شدة واتجاه الحمل المطبق.
في الأقسام التالية ، يتم وصف جميع الخطوات لقياس تفاعلات الأكتين-ميوسين-5B تحت أحمال مختلفة مع إعداد التحليل الطيفي فائق السرعة لمشبك القوة بشكل كامل ، بما في ذلك 1) إعداد الإعداد البصري ، ومحاذاة الفخاخ البصرية وإجراءات المعايرة ، 2) الاستعدادات لجميع المكونات وتجميعها في غرفة العينة ، 3) إجراء القياس ، 4) البيانات التمثيلية وتحليل البيانات لاستخراج المعلمات الفيزيائية الهامة ، مثل طول التشغيل وحجم الخطوة وسرعة البروتين الحركي.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن تقنيات الجزيء الواحد ، مثل الفحص ثلاثي الخرز ، تمثل تحديا تقنيا وإنتاجية منخفضة ، إلا أن UFFCS يحسن اكتشاف التفاعلات الجزيئية بفضل نسبة الإشارة إلى الضوضاء العالية للبيانات. يسمح UFFCS بدراسة الاعتماد على الحمل للبروتينات الحركية ، مع المزايا الرئيسية لتطبيق القوة بسرعة كبيرة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية المنحة رقم 871124 Laserlab-Europe ، من قبل وزارة الجامعات والبحوث الإيطالية (FIRB “Futuro in Ricerca” 2013 Grant No. RBFR13V4M2) ، ومن قبل Ente Cassa di Risparmio di Firenze. تم دعم A.V. Kashchuk من قبل زمالة متعددة التخصصات لبرنامج علوم الحدود البشرية LT008 / 2020-C.
Materials
| Aliphatic Amine Latex Beads | ThermoFisher | A37362 | 1.0-μm diameter, 2% (w/v) |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Actin polymerization buffer | Cytoskeleton | BSA02 | 10X |
| AODs (acousto-optic deflectors) | AA Opto Electronic | DTS-XY 250 | Laser beam deflectors |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Biotinylated-BSA | ThermoFisher | 29130 | |
| BSA | Sigma | B4287 | |
| Calmodulin from porcine brain (CaM) | Merck Millipore | 208783 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C40 | |
| Condenser | Olympus | OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat | NA 1.4, oil immersion |
| Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate | Sigma | 27920 | |
| Creatine Phosphokinase from rabbit muscle | Sigma | C3755 | |
| DDs | AA Opto Electronic | AA.DDS.XX | Two-channel digital synthesizer |
| DL-Dithiothreitol (DTT)/td> | Sigma | 43819 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| G-actin protein | Cytoskeleton | AKL99 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger | Sigma | G7141 | |
| HaloTag succinimidyl ester O2 ligand | Promega | P1691 | |
| High vacuum silicone grease heavy | Merck Millipore | 107921 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| KH2PO4/K2HPO4 | Sigma | P5379/ P8281 | |
| Labview | National Instruments | version 8.1 | Data acquisition |
| Labview FPGA module | National Instruments | version 8.1 | Fast Force-Clamp |
| Matlab | MathWorks | 2016 | Data analysis |
| MgCl2 | Fluka | 63020 | |
| Microscope Objective | Nikon | Plan-Apo 60X | NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm. |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| Nitrocellulose | Sigma | N8267 | 0.45 pore size |
| Pentyl acetate solution | Sigma | 46022 | |
| Pure Ethanol | Sigma | 2860 | |
| QPDs | UDT | DLS-20 | D Position Detecto |
| Rhodamine BSA | Molecular Probes | A23016 | |
| Rhodamine Phalloidin | Sigma | P1951 | |
| Silica beads | Bangslabs | SS04N | 1.21 mm, 10% solids |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Streptavidin protein | Sigma | 189730 |
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).
- Capitanio, M., Pavone, F. S. Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers. Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).
- Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).
- Gardini, L., et al. Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin. eLife. 8, 49266 (2019).
- Clemen, A. E. -. M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., Bä, M., Rief, M. Force-dependent stepping kinetics of myosin-V. Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).
- Howard, J., Hancock, W. O. Three beads are better than one. Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).
- Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. Modulation of kinesin’s load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track. Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).
- Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence. Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).
- Capitanio, M. . Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , (2017).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).
- Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors. Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).
- Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).
- Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions. Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).
- Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).
- Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
- Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Schäffer, E. Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).
