초고속 포스 클램프 분광법을 사용한 공정 미오신의 기계적 효소 특성 해부
Summary
여기에 제시된 것은 공정 myosin-5 모터에 대한 초고속 포스 클램프 실험을 수행하는 포괄적인 프로토콜이며, 이는 다른 등급의 공정 모터 연구로 쉽게 확장될 수 있습니다. 프로토콜은 실험 장치의 설정에서 샘플 준비, 데이터 수집 및 분석에 이르기까지 필요한 모든 단계를 자세히 설명합니다.
Abstract
초고속 포스 클램프 분광법(UFFCS)은 레이저 핀셋을 기반으로 하는 단일 분자 기술로, 전례 없는 시간 분해능으로 부하가 걸린 기존 및 비기존 미오신 모두의 화학 역학을 조사할 수 있습니다. 특히, 액틴-미오신 결합 형성 직후 일정한 힘으로 미오신 모터를 프로브 할 수있는 가능성과 높은 힘 피드백 속도 (200kHz)는 UFFCS가 미오신 작동 스트로크와 같은 빠른 역학의 부하 의존성을 연구하는 데 유용한 도구임을 보여주었습니다. 또한 UFFCS는 프로세스 및 비 프로세스 미오신 – 액틴 상호 작용이 적용된 힘의 강도와 방향에 의해 어떻게 영향을 받는지에 대한 연구를 가능하게합니다.
이 프로토콜을 따르면 공정 미오신 -5 모터와 다양한 비 전통적인 미오신에 대한 초고속 포스 클램프 실험을 수행 할 수 있습니다. 일부 조정에 의해, 프로토콜은 또한 키네신 및 다인과 같은 다른 종류의 프로세스 모터에 대한 연구로 쉽게 확장 될 수 있습니다. 프로토콜에는 실험 장치의 설정에서 샘플 준비, 교정 절차, 데이터 수집 및 분석에 이르기까지 필요한 모든 단계가 포함됩니다.
Introduction
지난 수십 년 동안 광학 핀셋은 구조적 변화와 효소 동역학 1,2의 동시 조작 및 측정의 놀라운 가능성으로 인해 단일 분자 수준에서 단백질 상호 작용의 기계 화학을 설명하는 데 유용한 도구였습니다. 특히, 나노미터 미만의 구조적 변화를 측정하는 능력과 함께 세포에서 분자 모터가 가하는 힘 범위의 힘을 적용하고 측정하는 기능은 광학 핀셋을 모터 단백질의 화학기계적 특성과 기계적 조절을 풀기 위한 고유한 단일 분자 도구로 만들었습니다.
초고속 포스 클램프 분광법(UFFCS)은 광학 핀셋을 기반으로 하는 단일 분자 포스 분광법 기술로, 3비드 형상(그림 1a)3,4에서 부하 상태에서 분자 모터의 빠른 동역학을 연구하기 위해 개발되었습니다. UFFCS는 광학 핀셋의 물리적 한계, 즉 시스템의 기계적 이완 시간까지 모터 단백질에 힘을 가하는 시간 지연을 줄여 미오신 실행 시작 후 (수십 마이크로 초) 힘을 빠르게 적용 할 수 있습니다 3. 이 기능은 빠른 골격 3 및 심장5 근육 미오신의 초기 기계적 이벤트를 조사하여 파워 스트로크의 부하 의존성, 약한 결합 및 강한 결합 상태, 생화학 적 (Pi) 및 기계적 (파워 스트로크) 이벤트의 순서를 밝히는 데 활용되었습니다.
3-비드 기하학은 일반적으로 비가공 모터를 연구하기 위해 사용되며, 힘 클램프가 있는 단일 비드 기하학은 일반적으로 미오신Va 6와 같은 가공성 비-통상적인 미오신을 조사하는 데 사용되었습니다. 그러나 처리성 미오신에 대해서도 3-비드 UFFCS 분석을 선호하는 몇 가지 이유가 있습니다. 첫째, 액틴-미오신 결합 직후 부하를 신속하게 적용하면 비공정 모터에서와 같이 힘 발달의 초기 이벤트를 측정할 수 있습니다. 또한 공정 모터의 경우 모터의 작동 길이와 진행 내내 일정한 힘 하에서 작동 시간을 정확하게 측정할 수 있습니다(그림 1b). 또한, 힘 피드백의 비율이 높기 때문에, 시스템은 미오신 작동 행정과 같은 위치의 빠른 변화 동안 힘을 일정하게 유지할 수 있으며, 따라서 모터 스테핑 동안 일정한 부하를 보장 할 수있다. 시스템의 높은 시간적 분해능은 서브 ms 상호 작용의 검출을 허용하여 미오신과 액틴의 약한 결합을 조사 할 가능성을 열어줍니다. 마지막으로, 분석 기하학은 힘이 액틴 필라멘트를 따라 적용되고 힘의 가로 및 수직 성분이 무시할 수 있음을 보장합니다. 이 점은 수직력 성분이 모터의 동역학 7,8의 부하 의존성에 상당한 영향을 미치는 것으로 나타 났기 때문에 특히 관련이 있습니다. 이 기술을 사용하여 다양한 보조 및 저항 부하를 처리 myosin-5B에 적용하고광범위한 힘에 대한 가공성의 부하 의존성을 직접 측정할 수 있습니다4.
그림 1a에 표시된 바와 같이이 시스템에서 단일 액틴 필라멘트는 이중 광학 핀셋 ( “덤벨”)의 초점에 갇힌 두 개의 폴리스티렌 비드 사이에 매달려 있습니다. 불균형 순 힘 F = F1-F 2 는 빠른 피드백 시스템을 통해 필라멘트에 부과되며, 이는 필라멘트가 순 힘이 반대 방향으로 반전되는 사용자 정의 반전 지점에 도달 할 때까지 한 방향으로 일정한 속도로 움직이게합니다. 운동 단백질이 필라멘트와 상호 작용하지 않을 때 덤벨은 단일 운동 단백질이 부착된 받침대 비드에 걸쳐 삼각형 파형(그림 1b, 하단 패널)으로 앞뒤로 자유롭게 움직일 수 있습니다. 상호 작용이 확립되면 덤벨이 전달하는 힘이 운동 단백질로 매우 빠르게 전달되고 모터는 미오신이 액틴에서 분리 될 때까지 상호 작용시 피드백 시스템에 의해 적용된 힘의 강도와 방향으로 밟아 필라멘트를 변위하기 시작합니다. 갇힌 액틴 필라멘트의 극성에 의존하는 모터의 스테핑에 의해 생성되는 변위이기 때문에 적용된 힘의 방향에 따라 하중은 보조, 즉 모터 변위의 동일한 방향으로 밀기(그림 1b 상단 패널에서 푸시) 또는 저항, 즉 모터 변위에 대해 반대 방향으로 당기는 것일 수 있습니다(그림 1b에서 당김). 상부 패널)을 통해 적용된 하중의 강도와 방향성 모두에 의해 모터 과정성의 화학 역학적 조절을 연구 할 수 있습니다.
다음 섹션에서는 초고속 포스 클램프 분광법 설정을 사용하여 다양한 부하에서 액틴-미오신 -5B 상호 작용을 측정하는 모든 단계를 완전히 설명하며, 여기에는 1) 광학 설정 설정, 광학 트랩 정렬 및 교정 절차, 2) 샘플 챔버에서 모든 구성 요소 준비 및 조립, 3) 측정 절차, 4) 운동 단백질의 실행 길이, 스텝 크기 및 속도와 같은 중요한 물리적 매개 변수를 추출하기위한 대표 데이터 및 데이터 분석.
Protocol
Representative Results
Discussion
3-비드 분석과 같은 단일 분자 기술은 기술적으로 까다롭고 처리량이 낮지만 UFFCS는 데이터의 높은 신호 대 잡음비 덕분에 분자 상호 작용 감지를 향상시킵니다. UFFCS는 모터 단백질의 부하 의존성을 연구 할 수있게하며, 모터가 필라멘트에 결합 할 때 힘을 매우 빠르게 적용하여 제어 된 힘 하에서 힘 생성 및 약한 결합 상태에서 조기에 매우 빠른 이벤트를 조사하는 주요 이점이 있습니다. 실행 내…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 보조금 계약 No. 871124 Laserlab-Europe에 따른 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램, 이탈리아 대학 및 연구부(FIRB “Futuro in Ricerca” 2013 Grant No. RBFR13V4M2) 및 Ente Cassa di Risparmio di Firenze의 지원을 받았습니다. A.V. Kashchuk은 Human Frontier Science Program Cross-Disciplinary Fellowship LT008 / 2020-C의 지원을 받았습니다.
Materials
| Aliphatic Amine Latex Beads | ThermoFisher | A37362 | 1.0-μm diameter, 2% (w/v) |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Actin polymerization buffer | Cytoskeleton | BSA02 | 10X |
| AODs (acousto-optic deflectors) | AA Opto Electronic | DTS-XY 250 | Laser beam deflectors |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Biotinylated-BSA | ThermoFisher | 29130 | |
| BSA | Sigma | B4287 | |
| Calmodulin from porcine brain (CaM) | Merck Millipore | 208783 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C40 | |
| Condenser | Olympus | OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat | NA 1.4, oil immersion |
| Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate | Sigma | 27920 | |
| Creatine Phosphokinase from rabbit muscle | Sigma | C3755 | |
| DDs | AA Opto Electronic | AA.DDS.XX | Two-channel digital synthesizer |
| DL-Dithiothreitol (DTT)/td> | Sigma | 43819 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| G-actin protein | Cytoskeleton | AKL99 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger | Sigma | G7141 | |
| HaloTag succinimidyl ester O2 ligand | Promega | P1691 | |
| High vacuum silicone grease heavy | Merck Millipore | 107921 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| KH2PO4/K2HPO4 | Sigma | P5379/ P8281 | |
| Labview | National Instruments | version 8.1 | Data acquisition |
| Labview FPGA module | National Instruments | version 8.1 | Fast Force-Clamp |
| Matlab | MathWorks | 2016 | Data analysis |
| MgCl2 | Fluka | 63020 | |
| Microscope Objective | Nikon | Plan-Apo 60X | NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm. |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| Nitrocellulose | Sigma | N8267 | 0.45 pore size |
| Pentyl acetate solution | Sigma | 46022 | |
| Pure Ethanol | Sigma | 2860 | |
| QPDs | UDT | DLS-20 | D Position Detecto |
| Rhodamine BSA | Molecular Probes | A23016 | |
| Rhodamine Phalloidin | Sigma | P1951 | |
| Silica beads | Bangslabs | SS04N | 1.21 mm, 10% solids |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Streptavidin protein | Sigma | 189730 |
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).
- Capitanio, M., Pavone, F. S. Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers. Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).
- Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).
- Gardini, L., et al. Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin. eLife. 8, 49266 (2019).
- Clemen, A. E. -. M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., Bä, M., Rief, M. Force-dependent stepping kinetics of myosin-V. Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).
- Howard, J., Hancock, W. O. Three beads are better than one. Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).
- Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. Modulation of kinesin’s load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track. Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).
- Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence. Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).
- Capitanio, M. . Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , (2017).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).
- Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors. Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).
- Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).
- Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions. Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).
- Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).
- Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
- Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Schäffer, E. Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).
