超快力钳谱分析合成性肌球蛋白的机械酶学特性
Summary
这里介绍的是在合成肌球蛋白-5电机上进行超快力钳实验的综合协议，可以很容易地扩展到其他类别的加工电机的研究。该协议详细说明了所有必要的步骤，从实验设备的设置到样品制备，数据采集和分析。
Abstract
超快力钳谱（UFFCS）是一种基于激光镊子的单分子技术，可以以前所未有的时间分辨率研究传统和非常规肌球蛋白在负载下的化学力学。特别是，在肌动蛋白-肌球蛋白键形成后立即在恒定力下探测肌球蛋白马达的可能性，以及高速率的力反馈（200 kHz），表明UFFCS是研究快速动力学（如肌球蛋白工作行程）的负载依赖性的宝贵工具。此外，UFFCS能够研究过程和非过程性肌球蛋白 – 肌动蛋白相互作用如何受到施加力的强度和方向的影响。
通过遵循该协议，将有可能在合成性肌球蛋白-5电机和各种非常规肌球蛋白上进行超快力钳实验。通过一些调整，该协议也可以很容易地扩展到其他类别的合成电机的研究，如驱动蛋白和动力蛋白。该协议包括所有必要的步骤，从实验设备的设置到样品制备，校准程序，数据采集和分析。
Introduction
在过去的几十年中，由于同时操纵和测量构象变化和酶动力学的可能性，光学镊子一直是阐明单分子水平蛋白质相互作用的机械化学的宝贵工具1，2。特别是，在细胞中分子马达施加的力范围内施加和测量力的能力，以及测量亚纳米构象变化的能力，使光镊成为一种独特的单分子工具，用于揭示运动蛋白的化学力学特性及其机械调节。
超快力钳谱 （UFFCS） 是一种基于光镊的单分子力谱技术，旨在研究三珠几何形状中分子电机在负载下的快速动力学（图 1a）3，4。UFFCS将施加到运动蛋白的力的时间滞后减少到光镊的物理极限，即系统的机械松弛时间，从而允许在肌球蛋白运行开始后快速施加力（几十微秒）3。这种能力已被用于研究快速骨骼 3 和心脏5 肌肉肌球蛋白的早期机械事件，以揭示动力冲程的负荷依赖性，弱结合状态和强结合状态，以及生化（Pi）和机械（动力冲程）事件的顺序。
三磁珠几何形状通常用于研究非加工性电机，具有力夹的单磁珠几何形状通常用于研究加工性非常规肌球蛋白，例如肌球蛋白Va6。然而，有几个原因也倾向于三珠UFFCS测定，用于治疗性肌球蛋白。首先，在肌动蛋白-肌球蛋白结合后立即快速施加负载，可以测量力发展的早期事件，就像在非过程性电机中一样。此外，对于加工型电机，它还允许在整个过程中精确测量电机在恒定力下的运行长度和运行持续时间（图 1b）。此外，由于力反馈率高，系统可以在快速改变位置时保持力恒定，例如肌球蛋白工作行程，从而保证电机步进期间的恒定负载。该系统的高时间分辨率允许检测亚毫秒相互作用，为研究肌球蛋白与肌动蛋白的弱结合提供了可能性。最后，测定几何形状保证力沿肌动蛋白丝施加，力的横向和垂直分量可以忽略不计。这一点特别重要，因为垂直力分量已被证明显着影响电机动力学的负载依赖性7，8。通过使用这种技术，我们可以对合成肌球蛋白-5B施加一系列辅助和电阻载荷，并直接测量其合成能力对宽范围力的负载依赖性4。
如图1a所示，在该系统中，单个肌动蛋白丝悬浮在捕获在双光镊聚焦中的两个聚苯乙烯珠（“哑铃”）之间。不平衡的净力F = F1-F 2通过快速反馈系统施加在灯丝上，该系统使灯丝在一个方向上以恒定的速度移动，直到到达用户定义的反转点，其中净力在相反方向上反转。当运动蛋白不与灯丝相互作用时，哑铃可以自由地以三角波形状（图1b，底图）来回移动，横跨附着单个运动蛋白的基座珠。一旦建立了相互作用，哑铃携带的力就会非常迅速地传递到运动蛋白上，并且马达开始在相互作用时反馈系统施加的力强度和方向下步进来取代细丝，直到肌球蛋白与肌动蛋白分离。由于电机步进产生的位移取决于被捕获的肌动蛋白丝的极性，根据施加力的方向，负载可以是辅助的，即沿电机位移的同一方向推动（图1b上图中的推动），也可以是电阻性的，即相对于电机位移以相反的方向拉动（图1b中的拉力） 上图），从而可以通过施加负载的强度和方向性来研究运动合成力的化学力学调节。
在接下来的部分中，将全面描述使用超快力钳谱设置在不同负载下测量肌动蛋白-肌球蛋白-5B 相互作用的所有步骤，包括 1） 光学设置的设置、光学陷阱对准和校准程序，2） 所有组件的制备及其在样品室中的组装，3） 测量程序， 4）代表性数据和数据分析，提取重要的物理参数，如运行长度、步长和运动蛋白的速度。
Protocol
Representative Results
Discussion
尽管单分子技术（例如三珠测定）在技术上具有挑战性且通量低，但由于数据的高信噪比，UFFCS提高了分子相互作用的检测。UFFCS允许研究运动蛋白的负载依赖性，其主要优点是在马达与灯丝结合时非常迅速地施加力，以探测力产生的早期和非常快速的事件以及在受控力下的弱结合状态;在整个运行过程中保持力恒定，并通过完全控制力方向性来探测电机依赖性。关于最后一点，我们在这里使用的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了欧盟Horizon 2020研究和创新计划的支持，该计划根据Laserlab-Europe 871124号资助协议，意大利大学和研究部（FIRB“Ricerca的未来”2013年资助号RBFR13V4M2）和Ente Cassa di Risparmio di Firenze支持。A.V. Kashchuk 得到了人类前沿科学计划跨学科奖学金 LT008/2020-C 的支持。
Materials
| Aliphatic Amine Latex Beads | ThermoFisher | A37362 | 1.0-μm diameter, 2% (w/v) |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Actin polymerization buffer | Cytoskeleton | BSA02 | 10X |
| AODs (acousto-optic deflectors) | AA Opto Electronic | DTS-XY 250 | Laser beam deflectors |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Biotinylated-BSA | ThermoFisher | 29130 | |
| BSA | Sigma | B4287 | |
| Calmodulin from porcine brain (CaM) | Merck Millipore | 208783 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C40 | |
| Condenser | Olympus | OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat | NA 1.4, oil immersion |
| Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate | Sigma | 27920 | |
| Creatine Phosphokinase from rabbit muscle | Sigma | C3755 | |
| DDs | AA Opto Electronic | AA.DDS.XX | Two-channel digital synthesizer |
| DL-Dithiothreitol (DTT)/td> | Sigma | 43819 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| G-actin protein | Cytoskeleton | AKL99 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger | Sigma | G7141 | |
| HaloTag succinimidyl ester O2 ligand | Promega | P1691 | |
| High vacuum silicone grease heavy | Merck Millipore | 107921 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| KH2PO4/K2HPO4 | Sigma | P5379/ P8281 | |
| Labview | National Instruments | version 8.1 | Data acquisition |
| Labview FPGA module | National Instruments | version 8.1 | Fast Force-Clamp |
| Matlab | MathWorks | 2016 | Data analysis |
| MgCl2 | Fluka | 63020 | |
| Microscope Objective | Nikon | Plan-Apo 60X | NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm. |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| Nitrocellulose | Sigma | N8267 | 0.45 pore size |
| Pentyl acetate solution | Sigma | 46022 | |
| Pure Ethanol | Sigma | 2860 | |
| QPDs | UDT | DLS-20 | D Position Detecto |
| Rhodamine BSA | Molecular Probes | A23016 | |
| Rhodamine Phalloidin | Sigma | P1951 | |
| Silica beads | Bangslabs | SS04N | 1.21 mm, 10% solids |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Streptavidin protein | Sigma | 189730 |
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).
- Capitanio, M., Pavone, F. S. Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers. Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).
- Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).
- Gardini, L., et al. Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin. eLife. 8, 49266 (2019).
- Clemen, A. E. -. M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., Bä, M., Rief, M. Force-dependent stepping kinetics of myosin-V. Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).
- Howard, J., Hancock, W. O. Three beads are better than one. Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).
- Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. Modulation of kinesin’s load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track. Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).
- Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence. Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).
- Capitanio, M. . Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , (2017).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).
- Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors. Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).
- Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).
- Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions. Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).
- Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).
- Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
- Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Schäffer, E. Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).
