Dissekering af mekanoenzymatiske egenskaber af processive myosiner med ultrahurtig kraftklemmespektroskopi

Summary

Præsenteret her er en omfattende protokol til udførelse af ultrahurtige kraftklemmeforsøg på processive myosin-5-motorer, som let kan udvides til undersøgelsen af andre klasser af processive motorer. Protokollen beskriver alle de nødvendige trin, fra opsætning af forsøgsapparatet til prøveforberedelse, dataindsamling og analyse.

Abstract

Ultrafast force-clamp spektroskopi (UFFCS) er en enkelt molekyleteknik baseret på laserpincet, der muliggør undersøgelse af kemomekanikken af både konventionelle og ukonventionelle myosiner under belastning med hidtil uset tidsopløsning. Især muligheden for at undersøge myosinmotorer under konstant kraft lige efter actin-myosinbindingsdannelsen sammen med den høje hastighed af kraftfeedbacken (200 kHz) har vist, at UFFCS er et værdifuldt værktøj til at studere belastningsafhængigheden af hurtig dynamik såsom myosin-arbejdsslag. Desuden muliggør UFFCS undersøgelsen af, hvordan processive og ikke-processive myosin-actin-interaktioner påvirkes af intensiteten og retningen af den påførte kraft.

Ved at følge denne protokol vil det være muligt at udføre ultrahurtige kraftklemmeeksperimenter på processive myosin-5-motorer og på en række ukonventionelle myosiner. Ved nogle justeringer kunne protokollen også let udvides til studiet af andre klasser af processive motorer såsom kinesiner og dyneiner. Protokollen indeholder alle de nødvendige trin, fra opsætning af forsøgsapparatet til prøveforberedelse, kalibreringsprocedurer, dataindsamling og analyse.

Introduction

I de sidste årtier har optiske pincetter været et værdifuldt værktøj til at belyse mekanokemien af proteininteraktioner på enkeltmolekyleniveau på grund af den slående mulighed for samtidig manipulation og måling af konformationsændringer og enzymatisk kinetik ^1,2. Især evnen til at anvende og måle kræfter inden for dem, der udøves af molekylære motorer i cellen, sammen med evnen til at måle subnanometer konformationelle ændringer, gjorde optiske pincetter til et unikt enkeltmolekyleværktøj til at optrævle de kemomekaniske egenskaber af motorproteiner og deres mekaniske regulering.

Ultrafast force-clamp spektroscopy (UFFCS) er en enkeltmolekyle kraftspektroskopiteknik baseret på optisk pincet, udviklet til at studere den hurtige kinetik af molekylære motorer under belastning i en tre-perlegeometri (figur 1a)^3,4. UFFCS reducerer tidsforsinkelsen for kraftpåføring på motorproteinet til den fysiske grænse for optisk pincet, dvs. systemets mekaniske afslapningstid, hvilket muliggør påføring af kraften hurtigt efter begyndelsen af en myosinkørsel (få titalls mikrosekunder)³. Denne evne er blevet udnyttet til at undersøge de tidlige mekaniske hændelser i hurtig skelet ³ og hjerte⁵ muskelmyosin for at afsløre belastningsafhængigheden af kraftslaget, de svage og stærke bindingstilstande samt rækkefølgen af biokemiske (Pi) og mekaniske (powerstroke) begivenheder.

Tre-perlegeometrien anvendes normalt til at studere ikke-processive motorer, en enkelt perlegeometri med en kraftklemme er blevet almindeligt anvendt til at undersøge processive ikke-konventionelle myosiner såsom myosin Va⁶. Der er dog flere grunde til at foretrække et tre-perle UFFCS-assay også for processive myosiner. For det første tillader den hurtige påføring af belastning lige efter actin-myosinbinding måling af de tidlige begivenheder i kraftudvikling som i ikke-processive motorer. Derudover giver det i tilfælde af procesmotorer også mulighed for en nøjagtig måling af motorens driftslængder og driftsvarighed under konstant kraft gennem hele deres progression (figur 1b). På grund af den høje hastighed af kraftfeedbacken kan systemet desuden opretholde kraftkonstanten under hurtige positionsændringer, såsom myosinarbejdsslaget, hvilket garanterer en konstant belastning under motortrin. Systemets høje tidsmæssige opløsning tillader påvisning af sub-ms-interaktioner, hvilket åbner muligheden for at undersøge svag binding af myosin til actin. Endelig garanterer analysegeometrien, at kraften påføres langs actinfilamentet med ubetydelige tværgående og lodrette komponenter af kraften. Dette punkt er af særlig relevans, da den vertikale kraftkomponent har vist sig at påvirke belastningsafhængigheden af motorens kinetik^{betydeligt 7,8}. Ved at bruge denne teknik kunne vi anvende en række assisterende og resistive belastninger til processiv myosin-5B og direkte måle belastningsafhængigheden af dens processivitet for en lang række kræfter⁴.

Som vist i figur 1a er der i dette system ophængt en enkelt actinglødetråd mellem to polystyrenperler, der er fanget i fokus på dobbelt optisk pincet (“håndvægten”). Glødetråden pålægges en ubalanceret nettokraft F= F 1-F2 gennem et hurtigt feedbacksystem, som får glødetråden til at bevæge sig med konstant hastighed i én retning, indtil den når et brugerdefineret inversionspunkt, hvor nettokraften vendes i modsat retning. Når motorproteinet ikke interagerer med glødetråden, er håndvægten fri til at bevæge sig frem og tilbage i en trekantet bølgeform (figur 1b, bundpanel), der spænder over piedestalperlen, hvorpå et enkelt motorprotein er fastgjort. Når interaktionen er etableret, overføres kraften, der bæres af håndvægten, meget hurtigt til motorproteinet, og motoren begynder at forskyde glødetråden ved at træde under den kraftintensitet og retning, der blev anvendt af feedbacksystemet på tidspunktet for interaktionen, indtil myosin løsner sig fra actin. Da belastningen er den forskydning, der frembringes ved motorens trin, afhængig af polariteten af det fangede actinfilament, kan belastningen i henhold til retningen af den påførte kraft enten være hjælpende, dvs. skubbe i samme retning af motorforskydningen (skub i figur 1b øverste panel) eller resistiv, dvs. trække i modsat retning i forhold til motorforskydningen (træk i figur 1b øverste panel), hvilket gør det muligt at studere den kemomekaniske regulering af motorprocessiviteten ved både intensiteten og retningen af den påførte belastning.

I de næste afsnit beskrives alle trin til måling af actin-myosin-5B-interaktioner under forskellige belastninger med en ultrahurtig kraftklemmespektroskopiopsætning fuldt ud, herunder 1) opsætning af den optiske opsætning, justering af optiske fælder og kalibreringsprocedurer, 2) forberedelserne af alle komponenter og deres samling i prøvekammeret, 3) måleproceduren, 4) Repræsentative data og dataanalyse for at udtrække vigtige fysiske parametre, såsom kørselslængden, trinstørrelsen og hastigheden af motorproteinet.

Protocol

1. Optisk opsætning BEMÆRK: Den eksperimentelle opsætning består af dobbelt optisk pincet med nanometerpegestabilitet og < 1% laserintensitetsudsving. Under disse forhold garanteres håndvægtens stabilitet på nanometerniveau under typisk fældestivhed (0,1 pN/nm) og spænding (1 pN – få titalls pN). Figur 2 viser et detaljeret skema over den optiske opsætning. Optisk pincet design og konstruktion 9,10,11.<sup cl…

Representative Results

Repræsentative data består af positionsregistreringer over tid som vist i figur 4. I stillingsposten er to slags forskydninger synlige. For det første, når myosinmotoren ikke interagerer med actinfilamentet, bevæger de fangede perler sig med konstant hastighed mod opløsningens viskøse trækkraft, hvilket viser en lineær forskydning, der oscillerer inden for oscillationsområdet, der er indstillet af operatøren i en trekantet bølge3 (ikke synlig i </s…

Discussion

Selvom enkeltmolekyleteknikker, såsom treperleassayet, er teknisk udfordrende og lav gennemstrømning, forbedrer UFFCS detektionen af molekylære interaktioner takket være dataenes høje signal-støj-forhold. UFFCS tillader undersøgelse af belastningsafhængigheden af motorproteiner med de vigtigste fordele ved at anvende kraften meget hurtigt ved binding af motoren til glødetråden for at undersøge tidlige og meget hurtige begivenheder i kraftproduktion og svage bindingstilstande under kontrolleret kraft; Oprethold…

Materials

Aliphatic Amine Latex Beads	ThermoFisher	A37362	1.0-μm diameter, 2% (w/v)
Acetone	Sigma	32201
Actin polymerization buffer	Cytoskeleton	BSA02	10X
AODs (acousto-optic deflectors)	AA Opto Electronic	DTS-XY 250	Laser beam deflectors
ATP	Sigma	A7699
Biotinylated-BSA	ThermoFisher	29130
BSA	Sigma	B4287
Calmodulin from porcine brain (CaM)	Merck Millipore	208783
Catalase from bovine liver	Sigma	C40
Condenser	Olympus	OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat	NA 1.4, oil immersion
Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate	Sigma	27920
Creatine Phosphokinase from rabbit muscle	Sigma	C3755
DDs	AA Opto Electronic	AA.DDS.XX	Two-channel digital synthesizer
DL-Dithiothreitol (DTT)/td>	Sigma	43819
EGTA	Sigma	E4378
G-actin protein	Cytoskeleton	AKL99
Glucose	Sigma	G7528
Glucose Oxidase from Aspergillus niger	Sigma	G7141
HaloTag succinimidyl ester O2 ligand	Promega	P1691
High vacuum silicone grease heavy	Merck Millipore	107921
KCl	Sigma	P9541
KH2PO4/K2HPO4	Sigma	P5379/ P8281
Labview	National Instruments	version 8.1	Data acquisition
Labview FPGA module	National Instruments	version 8.1	Fast Force-Clamp
Matlab	MathWorks	2016	Data analysis
MgCl2	Fluka	63020
Microscope Objective	Nikon	Plan-Apo 60X	NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.
MOPS	Sigma	M1254
Nitrocellulose	Sigma	N8267	0.45 pore size
Pentyl acetate solution	Sigma	46022
Pure Ethanol	Sigma	2860
QPDs	UDT	DLS-20	D Position Detecto
Rhodamine BSA	Molecular Probes	A23016
Rhodamine Phalloidin	Sigma	P1951
Silica beads	Bangslabs	SS04N	1.21 mm, 10% solids
Sodium azide	Sigma	S2002
Streptavidin protein	Sigma	189730