Dissezione delle proprietà meccanoenzimatiche delle miosine processive con spettroscopia ultraveloce a force-clamp
Summary
Presentato qui è un protocollo completo per eseguire esperimenti di force-clamp ultraveloci su motori processivi miosina-5, che potrebbe essere facilmente esteso allo studio di altre classi di motori processivi. Il protocollo descrive in dettaglio tutte le fasi necessarie, dalla messa a punto dell’apparato sperimentale alla preparazione del campione, all’acquisizione dei dati e all’analisi.
Abstract
La spettroscopia force-clamp ultraveloce (UFFCS) è una tecnica a singola molecola basata su pinzette laser che consente lo studio della chemiomeccanica delle miosine convenzionali e non convenzionali sotto carico con una risoluzione temporale senza precedenti. In particolare, la possibilità di sondare motori di miosina sotto forza costante subito dopo la formazione del legame actina-miosina, insieme all’alto tasso di feedback di forza (200 kHz), ha dimostrato che l’UFFCS è un valido strumento per studiare la dipendenza dal carico di dinamiche veloci come la corsa di lavoro della miosina. Inoltre, UFFCS consente lo studio di come le interazioni miosina-actina processive e non processive sono influenzate dall’intensità e dalla direzione della forza applicata.
Seguendo questo protocollo, sarà possibile eseguire esperimenti di force-clamp ultraveloci su motori processivi di miosina-5 e su una varietà di miosine non convenzionali. Con alcuni aggiustamenti, il protocollo potrebbe anche essere facilmente esteso allo studio di altre classi di motori processivi come chinesine e dineine. Il protocollo comprende tutte le fasi necessarie, dalla messa a punto dell’apparato sperimentale alla preparazione del campione, alle procedure di taratura, all’acquisizione e all’analisi dei dati.
Introduction
Negli ultimi decenni le pinzette ottiche sono state un valido strumento per chiarire la meccanochimica delle interazioni proteiche a livello di singola molecola, grazie alla sorprendente possibilità di manipolazione e misurazione simultanea dei cambiamenti conformazionali e della cinetica enzimatica 1,2. In particolare, la capacità di applicare e misurare forze nell’intervallo di quelle esercitate dai motori molecolari nella cellula, insieme alla capacità di misurare i cambiamenti conformazionali sub-nanometrici, ha reso le pinzette ottiche uno strumento unico a singola molecola per svelare le proprietà chemiomeccaniche delle proteine motorie e la loro regolazione meccanica.
La spettroscopia force-clamp ultraveloce (UFFCS) è una tecnica di spettroscopia di forza a singola molecola basata su pinzette ottiche, sviluppata per studiare la cinetica veloce dei motori molecolari sotto carico in una geometria a tre sfere (Figura 1a)3,4. UFFCS riduce il ritardo temporale per l’applicazione della forza alla proteina motoria al limite fisico delle pinzette ottiche, cioè il tempo di rilassamento meccanico del sistema, consentendo così l’applicazione della forza rapidamente dopo l’inizio di una corsa di miosina (poche decine di microsecondi)3. Questa capacità è stata sfruttata per studiare i primi eventi meccanici nella miosina muscolare scheletrica 3 veloce e nella miosina muscolare cardiaca5 per rivelare la dipendenza dal carico del powerstroke, gli stati di legame debole e forte, nonché l’ordine degli eventi biochimici (Pi) e meccanici (powerstroke).
La geometria a tre sfere viene solitamente impiegata per studiare motori non processivi, una geometria a singola perla con un morsetto di forza è stata comunemente usata per studiare miosine non convenzionali processive come la miosina Va6. Tuttavia, ci sono diversi motivi per preferire un test UFFCS a tre sfere anche per le miosine processive. In primo luogo, la rapida applicazione del carico subito dopo il legame actina-miosina consente la misurazione degli eventi precoci nello sviluppo della forza come nei motori non processivi. Inoltre, nel caso dei motori processivi, consente anche una misurazione accurata delle lunghezze di corsa e della durata di corsa del motore sotto forza costante durante tutta la loro progressione (Figura 1b). Inoltre, a causa dell’elevata velocità di feedback della forza, il sistema può mantenere costante la forza durante rapidi cambi di posizione, come la corsa di lavoro della miosina, garantendo così un carico costante durante il passo del motore. L’elevata risoluzione temporale del sistema consente la rilevazione di interazioni sub-ms, aprendo la possibilità di indagare il legame debole della miosina all’actina. Infine, la geometria del saggio garantisce che la forza venga applicata lungo il filamento di actina, con componenti trasversali e verticali trascurabili della forza. Questo punto è di particolare rilevanza in quanto è stato dimostrato che la componente di forza verticale influenza significativamente la dipendenza dal carico della cinetica del motore 7,8. Utilizzando questa tecnica, potremmo applicare una gamma di carichi assistivi e resistivi alla miosina-5B processiva e misurare direttamente la dipendenza dal carico della sua processività per un’ampia gamma di forze4.
Come mostrato nella figura 1a, in questo sistema un singolo filamento di actina è sospeso tra due perle di polistirene intrappolate nel fuoco di una pinzetta ottica doppia (il “manubrio”). Una forza netta sbilanciata F = F1-F 2 viene imposta sul filamento, attraverso un sistema di feedback veloce, che fa muovere il filamento a velocità costante in una direzione fino a raggiungere un punto di inversione definito dall’utente in cui la forza netta viene invertita nella direzione opposta. Quando la proteina motrice non interagisce con il filamento, il manubrio è libero di muoversi avanti e indietro in una forma d’onda triangolare (Figura 1b, pannello inferiore) che attraversa il tallone del piedistallo su cui è attaccata una singola proteina motoria. Una volta stabilita l’interazione, la forza trasportata dal manubrio viene trasferita molto rapidamente alla proteina motoria e il motore inizia a spostare il filamento passando sotto l’intensità e la direzione della forza che è stata applicata dal sistema di feedback al momento dell’interazione, fino a quando la miosina si stacca dall’actina. Essendo lo spostamento prodotto dal passo del motore dipendente dalla polarità del filamento di actina intrappolato, a seconda della direzione della forza applicata il carico può essere assistivo, cioè spingendo nella stessa direzione dello spostamento del motore (spinta nel pannello superiore della figura 1b), o resistivo, cioè tirando nella direzione opposta rispetto allo spostamento del motore (trazione in figura 1b pannello superiore) che consente di studiare la regolazione chemiomeccanica della processività motoria sia per l’intensità che per la direzionalità del carico applicato.
Nelle sezioni successive vengono descritti in modo completo tutti i passaggi per misurare le interazioni actina-miosina-5B sotto diversi carichi con una configurazione spettroscopica force-clamp ultraveloce, tra cui 1) l’impostazione del setup ottico, l’allineamento delle trappole ottiche e le procedure di calibrazione, 2) la preparazione di tutti i componenti e il loro assemblaggio nella camera del campione, 3) la procedura di misura, 4) dati rappresentativi e analisi dei dati per estrarre importanti parametri fisici, come la lunghezza della corsa, la dimensione del passo e la velocità della proteina motoria.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sebbene le tecniche a singola molecola, come il saggio a tre perline, siano tecnicamente impegnative e a basso rendimento, UFFCS migliora il rilevamento delle interazioni molecolari grazie all’elevato rapporto segnale-rumore dei dati. UFFCS permette lo studio della carico-dipendenza delle proteine motorie, con i principali vantaggi di applicare la forza molto rapidamente al momento del legame del motore al filamento per sondare eventi precoci e molto rapidi nella produzione di forza e stati di legame deboli sotto forza c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell’Unione Europea nell’ambito del Grant Agreement n. 871124 Laserlab-Europe, dal Ministero dell’Università e della Ricerca (FIRB “Futuro in Ricerca” 2013 Grant No. RBFR13V4M2), e dall’Ente Cassa di Risparmio di Firenze. A.V. Kashchuk è stato supportato dalla Human Frontier Science Program Cross-Disciplinary Fellowship LT008/2020-C.
Materials
| Aliphatic Amine Latex Beads | ThermoFisher | A37362 | 1.0-μm diameter, 2% (w/v) |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Actin polymerization buffer | Cytoskeleton | BSA02 | 10X |
| AODs (acousto-optic deflectors) | AA Opto Electronic | DTS-XY 250 | Laser beam deflectors |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Biotinylated-BSA | ThermoFisher | 29130 | |
| BSA | Sigma | B4287 | |
| Calmodulin from porcine brain (CaM) | Merck Millipore | 208783 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C40 | |
| Condenser | Olympus | OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat | NA 1.4, oil immersion |
| Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate | Sigma | 27920 | |
| Creatine Phosphokinase from rabbit muscle | Sigma | C3755 | |
| DDs | AA Opto Electronic | AA.DDS.XX | Two-channel digital synthesizer |
| DL-Dithiothreitol (DTT)/td> | Sigma | 43819 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| G-actin protein | Cytoskeleton | AKL99 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger | Sigma | G7141 | |
| HaloTag succinimidyl ester O2 ligand | Promega | P1691 | |
| High vacuum silicone grease heavy | Merck Millipore | 107921 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| KH2PO4/K2HPO4 | Sigma | P5379/ P8281 | |
| Labview | National Instruments | version 8.1 | Data acquisition |
| Labview FPGA module | National Instruments | version 8.1 | Fast Force-Clamp |
| Matlab | MathWorks | 2016 | Data analysis |
| MgCl2 | Fluka | 63020 | |
| Microscope Objective | Nikon | Plan-Apo 60X | NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm. |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| Nitrocellulose | Sigma | N8267 | 0.45 pore size |
| Pentyl acetate solution | Sigma | 46022 | |
| Pure Ethanol | Sigma | 2860 | |
| QPDs | UDT | DLS-20 | D Position Detecto |
| Rhodamine BSA | Molecular Probes | A23016 | |
| Rhodamine Phalloidin | Sigma | P1951 | |
| Silica beads | Bangslabs | SS04N | 1.21 mm, 10% solids |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Streptavidin protein | Sigma | 189730 |
References
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