超高速フォースクランプ分光法によるミオシンのメカノ酵素的性質の解剖
Summary
ここでは、処理ミオシン-5モーターで超高速フォースクランプ実験を行うための包括的なプロトコルを提示し、他のクラスのプロセスモーターの研究に簡単に拡張できます。プロトコルは、実験装置のセットアップからサンプル調製、データ収集、分析まで、必要なすべてのステップを詳述しています。
Abstract
超高速フォースクランプ分光法(UFFCS)は、レーザーピンセットに基づく単一分子技術であり、前例のない時間分解能で負荷がかかった状態での従来型および非従来型ミオシンの両方の化学力学の研究を可能にします。特に、アクチン-ミオシン結合形成直後に一定の力でミオシンモーターをプローブする可能性は、フォースフィードバックの高速レート(200kHz)とともに、UFFCSがミオシン作業ストロークなどの高速ダイナミクスの負荷依存性を研究するための貴重なツールであることを示しています。さらに、UFFCSは、プロセス的および非プロセス的なミオシン-アクチン相互作用が、加えられた力の強度と方向によってどのように影響を受けるかの研究を可能にします。
このプロトコルに従うことで、プロセスミオシン-5モーターやさまざまな非従来型ミオシンで超高速フォースクランプ実験を行うことが可能になります。いくつかの調整により、プロトコルは、キネシンやダイニンなどの他のクラスの処理モーターの研究にも簡単に拡張できます。プロトコルには、実験装置のセットアップからサンプル調製、校正手順、データ取得、分析まで、必要なすべてのステップが含まれています。
Introduction
過去数十年にわたり、光ピンセットは、立体構造変化と酵素速度論の同時操作と測定の顕著な可能性により、単一分子レベルでタンパク質相互作用のメカノケミストリーを解明するための貴重なツールでした1,2。特に、細胞内の分子モーターが及ぼす力の範囲の力を適用および測定する能力と、サブナノメートルの構造変化を測定する能力により、光ピンセットは、モータータンパク質の化学力学的特性とその機械的制御を解明するためのユニークな単一分子ツールになりました。
超高速フォースクランプ分光法(UFFCS)は、3ビーズ形状の負荷下での分子モーターの高速速度論を研究するために開発された、ピンセットに基づく単一分子力分光法です(図1a)3,4。UFFCSは、モータータンパク質への力の加わるタイムラグを光ピンセットの物理的限界、すなわちシステムの機械的緩和時間まで短縮し、ミオシンの実行開始後(数十マイクロ秒)に迅速に力を加えることを可能にします3。この能力を利用して、高速骨格3および心臓5筋ミオシンの初期の機械的イベントを調査し、パワーストロークの負荷依存性、弱結合状態と強結合状態、および生化学的(Pi)および機械的(パワーストローク)イベントの順序を明らかにしました。
3ビード形状は通常、非加工モーターの研究に採用され、フォースクランプを備えた単一ビーズ形状は、ミオシンVa6などの加工型非従来型ミオシンの研究に一般的に使用されています。ただし、プロセシブミオシンに対しても3ビーズUFFCSアッセイを好む理由はいくつかあります。第一に、アクチン-ミオシン結合直後の荷重の迅速な適用により、非プロセスモーターと同様に力発生の初期事象の測定が可能になります。さらに、処理型モータの場合、モータの走行距離と走行時間を一定の力で正確に測定することもできます(図1b)。さらに、フォースフィードバックのレートが高いため、システムはミオシン作業ストロークなどの位置の急速な変化中に力を一定に保つことができ、それによってモーターステッピング中の一定の負荷を保証します。システムの高時間分解能により、サブms相互作用の検出が可能になり、ミオシンのアクチンへの弱い結合を調査する可能性が開かれます。最後に、アッセイ形状は、力がアクチンフィラメントに沿って加えられることを保証し、力の横方向および垂直方向の成分はごくわずかです。垂直方向の力成分がモータの動力学7,8の負荷依存性に大きく影響することが示されているので、この点は特に関連性がある。この手法を用いることで、加工ミオシン-5Bにさまざまな補助荷重と抵抗荷重を適用し、広範囲の力に対する処理能力の荷重依存性を直接測定することができました4。
図1aに示すように、このシステムでは、単一のアクチンフィラメントが、二重光ピンセット(「ダンベル」)の焦点に閉じ込められた2つのポリスチレンビーズの間に吊り下げられています。不均衡な正味力F = F1-F 2は、高速フィードバックシステムを介してフィラメントに課され、フィラメントは、正味の力が反対方向に反転するユーザー定義の反転点に到達するまで、一方向に等速で移動します。モータータンパク質がフィラメントと相互作用していないとき、ダンベルは単一のモータータンパク質が付着している台座ビーズにまたがる三角形の波状(図1b、下のパネル)で自由に前後に動きます。相互作用が確立されると、ダンベルによって運ばれる力はモータータンパク質に非常に急速に伝達され、モーターはミオシンがアクチンから分離するまで、相互作用時にフィードバックシステムによって加えられた力の強さと方向の下でステップすることによってフィラメントを移動させ始めます。トラップされたアクチンフィラメントの極性に依存するモーターのステッピングによって生成される変位であるため、負荷は、加えられた力の方向に応じて、補助的、つまりモーター変位と同じ方向に押す(図1b上のパネルを押す)、または抵抗性、つまりモーターの変位に対して反対方向に引っ張る(図1bの引っ張り)のいずれかになります。 上パネル)は、加えられた負荷の強度と方向性の両方によって運動処理能力の化学力学的調節を研究することを可能にする。
次のセクションでは、1)光学セットアップのセットアップ、光学トラップのアライメントとキャリブレーションの手順、2)サンプルチャンバー内のすべてのコンポーネントの準備とそれらのアセンブリ、3)測定手順、 4)ランレングス、ステップサイズ、モータータンパク質の速度などの重要な物理的パラメータを抽出するための代表的なデータとデータ分析。
Protocol
Representative Results
Discussion
3ビーズアッセイなどの単一分子技術は技術的に困難でスループットが低いですが、UFFCSはデータの高いS/N比により分子相互作用の検出を改善します。UFFCSは、モータータンパク質の負荷依存性の研究を可能にし、モーターがフィラメントに結合する際に非常に迅速に力を加えるという主な利点により、制御された力の下での力の生成および弱い結合状態における早期かつ非常に迅速な事象を?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、Laserlab-Europeの助成金契約番号871124に基づく欧州連合のHorizon 2020研究およびイノベーションプログラム、イタリア大学研究省(FIRB「Futuro in Ricerca」2013グラント番号RBFR13V4M2)、およびエンテカッサディリスパルミオディフィレンツェによってサポートされました。A.V. Kashchukは、ヒューマンフロンティアサイエンスプログラムの学際的フェローシップLT008 / 2020-Cの支援を受けました。
Materials
| Aliphatic Amine Latex Beads | ThermoFisher | A37362 | 1.0-μm diameter, 2% (w/v) |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Actin polymerization buffer | Cytoskeleton | BSA02 | 10X |
| AODs (acousto-optic deflectors) | AA Opto Electronic | DTS-XY 250 | Laser beam deflectors |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Biotinylated-BSA | ThermoFisher | 29130 | |
| BSA | Sigma | B4287 | |
| Calmodulin from porcine brain (CaM) | Merck Millipore | 208783 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C40 | |
| Condenser | Olympus | OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat | NA 1.4, oil immersion |
| Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate | Sigma | 27920 | |
| Creatine Phosphokinase from rabbit muscle | Sigma | C3755 | |
| DDs | AA Opto Electronic | AA.DDS.XX | Two-channel digital synthesizer |
| DL-Dithiothreitol (DTT)/td> | Sigma | 43819 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| G-actin protein | Cytoskeleton | AKL99 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger | Sigma | G7141 | |
| HaloTag succinimidyl ester O2 ligand | Promega | P1691 | |
| High vacuum silicone grease heavy | Merck Millipore | 107921 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| KH2PO4/K2HPO4 | Sigma | P5379/ P8281 | |
| Labview | National Instruments | version 8.1 | Data acquisition |
| Labview FPGA module | National Instruments | version 8.1 | Fast Force-Clamp |
| Matlab | MathWorks | 2016 | Data analysis |
| MgCl2 | Fluka | 63020 | |
| Microscope Objective | Nikon | Plan-Apo 60X | NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm. |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| Nitrocellulose | Sigma | N8267 | 0.45 pore size |
| Pentyl acetate solution | Sigma | 46022 | |
| Pure Ethanol | Sigma | 2860 | |
| QPDs | UDT | DLS-20 | D Position Detecto |
| Rhodamine BSA | Molecular Probes | A23016 | |
| Rhodamine Phalloidin | Sigma | P1951 | |
| Silica beads | Bangslabs | SS04N | 1.21 mm, 10% solids |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Streptavidin protein | Sigma | 189730 |
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).
- Capitanio, M., Pavone, F. S. Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers. Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).
- Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).
- Gardini, L., et al. Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin. eLife. 8, 49266 (2019).
- Clemen, A. E. -. M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., Bä, M., Rief, M. Force-dependent stepping kinetics of myosin-V. Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).
- Howard, J., Hancock, W. O. Three beads are better than one. Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).
- Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. Modulation of kinesin’s load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track. Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).
- Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence. Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).
- Capitanio, M. . Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , (2017).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).
- Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors. Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).
- Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).
- Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions. Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).
- Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).
- Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
- Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Schäffer, E. Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).
