Dissekera mekanoenzymatiska egenskaper hos processiva myosiner med ultrasnabb kraftklämspektroskopi
Summary
Här presenteras ett omfattande protokoll för att utföra ultrasnabba kraftklämma experiment på processiva myosin-5-motorer, som lätt kan utvidgas till studier av andra klasser av processiva motorer. Protokollet beskriver alla nödvändiga steg, från installationen av experimentapparaten till provberedning, datainsamling och analys.
Abstract
Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) är en enmolekylär teknik baserad på laserpincett som möjliggör undersökning av kemomekaniken hos både konventionella och okonventionella myosiner under belastning med oöverträffad tidsupplösning. I synnerhet har möjligheten att sondra myosinmotorer under konstant kraft direkt efter aktin-myosinbindningsbildningen, tillsammans med den höga hastigheten för kraftåterkopplingen (200 kHz), visat UFFCS vara ett värdefullt verktyg för att studera belastningsberoendet av snabb dynamik såsom myosinets arbetsslag. Dessutom möjliggör UFFCS studier av hur processiva och icke-processiva myosin-aktininteraktioner påverkas av intensiteten och riktningen hos den applicerade kraften.
Genom att följa detta protokoll kommer det att vara möjligt att utföra ultrasnabba kraftklämma experiment på processiva myosin-5-motorer och på en mängd olika okonventionella myosiner. Genom vissa justeringar kan protokollet också lätt utvidgas till studier av andra klasser av processiva motorer såsom kinesiner och dyneiner. Protokollet innehåller alla nödvändiga steg, från installationen av experimentapparaten till provberedning, kalibreringsförfaranden, datainsamling och analys.
Introduction
Under de senaste decennierna har optiska pincetter varit ett värdefullt verktyg för att belysa mekanokemin för proteininteraktioner på enmolekylnivå, på grund av den slående möjligheten till samtidig manipulation och mätning av konformationsförändringar och enzymatisk kinetik 1,2. I synnerhet förmågan att applicera och mäta krafter inom området för de som utövas av molekylära motorer i cellen, tillsammans med förmågan att mäta subnanometerkonformationsförändringar, gjorde optiska pincett till ett unikt enmolekylverktyg för att avslöja de kemomekaniska egenskaperna hos motorproteiner och deras mekaniska reglering.
Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) är en enmolekylär kraftspektroskopiteknik baserad på optisk pincett, utvecklad för att studera den snabba kinetiken hos molekylära motorer under belastning i en tre-pärlgeometri (figur 1a)3,4. UFFCS minskar tidsfördröjningen för kraftapplicering på motorproteinet till den fysiska gränsen för optisk pincett, dvs systemets mekaniska avkopplingstid, vilket möjliggör applicering av kraften snabbt efter början av en myosinkörning (några tiotals mikrosekunder)3. Denna förmåga har utnyttjats för att undersöka de tidiga mekaniska händelserna i snabb skelett 3 och hjärt5 muskelmyosin för att avslöja belastningsberoendet av kraftslag, de svaga och starka bindande tillstånden, liksom ordningen på biokemiska (Pi) och mekaniska (powerstroke) händelser.
Trepärlgeometrin används vanligtvis för att studera icke-processiva motorer, en enda pärlgeometri med en kraftklämma har vanligtvis använts för att undersöka processiva icke-konventionella myosiner såsom myosin Va6. Det finns dock flera skäl att föredra en UFFCS-analys med tre pärlor även för processiva myosiner. För det första möjliggör den snabba appliceringen av belastning direkt efter aktin-myosinbindning mätning av de tidiga händelserna i kraftutveckling som i icke-processiva motorer. När det gäller processiva motorer möjliggör den dessutom en noggrann mätning av motorns körlängder och körtider under konstant kraft under hela deras progression (figur 1b). På grund av den höga hastigheten på kraftåterkopplingen kan systemet dessutom hålla kraften konstant under snabba positionsförändringar, såsom myosinets arbetsslag, vilket garanterar en konstant belastning under motorstegning. Systemets högtidsupplösning möjliggör detektering av sub-ms-interaktioner, vilket öppnar möjligheten att undersöka svag bindning av myosin till aktin. Slutligen garanterar analysgeometrin att kraften appliceras längs aktinfilamentet, med försumbara tvärgående och vertikala komponenter av kraften. Denna punkt är särskilt relevant eftersom den vertikala kraftkomponenten har visat sig väsentligt påverka belastningsberoendet hos motorns kinetik 7,8. Genom att använda denna teknik kunde vi tillämpa en rad hjälpande och resistiva belastningar på processiv myosin-5B och direkt mäta belastningsberoendet av dess processivitet för ett brett spektrum av krafter4.
Som visas i figur 1a är i detta system ett enda aktinfilament upphängt mellan två polystyrenpärlor som fångas i fokus för dubbla optiska pincetter (“hanteln”). En obalanserad nettokraft F = F1-F 2 påförs glödtråden genom ett snabbt återkopplingssystem, vilket gör att glödtråden rör sig med konstant hastighet i en riktning tills den når en användardefinierad inversionspunkt där nettokraften vänds i motsatt riktning. När motorproteinet inte interagerar med filamentet kan hanteln röra sig fram och tillbaka i en triangulär vågform (figur 1b, bottenpanelen) som spänner över piedestalsträngen på vilken ett enda motorprotein är fäst. När interaktionen är etablerad överförs kraften som bärs av hanteln mycket snabbt till motorproteinet och motorn börjar förskjuta filamentet genom att kliva under kraftintensiteten och riktningen som applicerades av återkopplingssystemet vid tidpunkten för interaktionen tills myosin lossnar från aktin. Eftersom förskjutningen som produceras av motorns stegning är beroende av polariteten hos det fångade aktinfilamentet, beroende på riktningen för den applicerade kraften, kan belastningen antingen vara assisterande, dvs trycka i samma riktning av motorförskjutningen (tryck i figur 1b övre panelen) eller resistiv, dvs dra i motsatt riktning med avseende på motorförskjutningen (dra i figur 1b övre panelen) vilket gör det möjligt att studera den kemomekaniska regleringen av motorprocessiviteten med både intensiteten och riktningen hos den applicerade belastningen.
I nästa avsnitt beskrivs alla steg för att mäta aktin-myosin-5B-interaktioner under olika belastningar med en ultrasnabb kraft-klämspektroskopiinställning fullständigt, inklusive 1) installationen av den optiska installationen, optiska fällor justering och kalibreringsprocedurer, 2) förberedelserna av alla komponenter och deras montering i provkammaren, 3) mätproceduren, 4) representativa data och dataanalys för att extrahera viktiga fysikaliska parametrar, såsom körlängd, stegstorlek och motorproteinets hastighet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Även om enmolekylära tekniker, såsom tre-pärlanalysen, är tekniskt utmanande och låg genomströmning, förbättrar UFFCS detekteringen av molekylära interaktioner tack vare det höga signal-brusförhållandet mellan data. UFFCS möjliggör studier av belastningsberoende av motorproteiner, med de främsta fördelarna med att applicera kraften mycket snabbt vid bindning av motorn till filamentet för att undersöka tidiga och mycket snabba händelser i kraftproduktion och svaga bindningstillstånd under kontrollerad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 enligt bidragsavtal nr 871124 Laserlab-Europe, av det italienska ministeriet för universitet och forskning (FIRB “Futuro in Ricerca” 2013 Grant No. RBFR13V4M2) och av Ente Cassa di Risparmio di Firenze. A.V. Kashchuk stöddes av Human Frontier Science Program Cross-Disciplinary Fellowship LT008/2020-C.
Materials
| Aliphatic Amine Latex Beads | ThermoFisher | A37362 | 1.0-μm diameter, 2% (w/v) |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Actin polymerization buffer | Cytoskeleton | BSA02 | 10X |
| AODs (acousto-optic deflectors) | AA Opto Electronic | DTS-XY 250 | Laser beam deflectors |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| Biotinylated-BSA | ThermoFisher | 29130 | |
| BSA | Sigma | B4287 | |
| Calmodulin from porcine brain (CaM) | Merck Millipore | 208783 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C40 | |
| Condenser | Olympus | OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat | NA 1.4, oil immersion |
| Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate | Sigma | 27920 | |
| Creatine Phosphokinase from rabbit muscle | Sigma | C3755 | |
| DDs | AA Opto Electronic | AA.DDS.XX | Two-channel digital synthesizer |
| DL-Dithiothreitol (DTT)/td> | Sigma | 43819 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| G-actin protein | Cytoskeleton | AKL99 | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Glucose Oxidase from Aspergillus niger | Sigma | G7141 | |
| HaloTag succinimidyl ester O2 ligand | Promega | P1691 | |
| High vacuum silicone grease heavy | Merck Millipore | 107921 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| KH2PO4/K2HPO4 | Sigma | P5379/ P8281 | |
| Labview | National Instruments | version 8.1 | Data acquisition |
| Labview FPGA module | National Instruments | version 8.1 | Fast Force-Clamp |
| Matlab | MathWorks | 2016 | Data analysis |
| MgCl2 | Fluka | 63020 | |
| Microscope Objective | Nikon | Plan-Apo 60X | NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm. |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| Nitrocellulose | Sigma | N8267 | 0.45 pore size |
| Pentyl acetate solution | Sigma | 46022 | |
| Pure Ethanol | Sigma | 2860 | |
| QPDs | UDT | DLS-20 | D Position Detecto |
| Rhodamine BSA | Molecular Probes | A23016 | |
| Rhodamine Phalloidin | Sigma | P1951 | |
| Silica beads | Bangslabs | SS04N | 1.21 mm, 10% solids |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | |
| Streptavidin protein | Sigma | 189730 |
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).
- Capitanio, M., Pavone, F. S. Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers. Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).
- Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).
- Gardini, L., et al. Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin. eLife. 8, 49266 (2019).
- Clemen, A. E. -. M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., Bä, M., Rief, M. Force-dependent stepping kinetics of myosin-V. Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).
- Howard, J., Hancock, W. O. Three beads are better than one. Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).
- Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. Modulation of kinesin’s load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track. Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).
- Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence. Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).
- Capitanio, M. . Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , (2017).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).
- Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors. Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).
- Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).
- Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions. Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).
- Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).
- Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
- Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Schäffer, E. Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).
