JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

מודל כירורגי מותאם של איסכמיה בגפיים אחוריות ב- ApoE-/- עכברים באמצעות חתך מיניאטורי

Published: May 13, 2021
doi:
10.3791/62402
, , , , ,
1Department of Surgery, Medical Faculty Manheim,Heidelberg University, 2European Center of Angioscience ECAS, Medical Faculty Manheim,Heidelberg University, 3Computer-Assisted Clinical Medicine, Mannheim Institute for Intelligent Systems in Medicine, Medical Faculty Mannheim,Heidelberg University, 4Cooperative Core Facility Animal Scanner ZI, Medical Faculty Mannheim,Heidelberg University

Summary

מאמר זה מדגים גישה כירורגית יעילה ליצירת איסכמיה חריפה בעכברים עם חתך קטן. גישה זו יכולה להיות מיושמת על ידי רוב קבוצות המחקר ללא כל שדרוגי מעבדה.

Abstract

מטרת מחקר זה היא להציג ולהעריך גישה כירורגית שונה כדי לגרום איסכמיה חריפה בעכברים שניתן ליישם ברוב מעבדות בעלי החיים. בניגוד לגישה הקונבנציונלית לקשירה כפולה של עורק הירך (DLFA), נעשה חנק קטן יותר באזור המ מפשעתי הימני כדי לחשוף את עורק הירך הפרוקסימלי (FA) לביצוע DLFA. לאחר מכן, באמצעות תימה 7-0, החתירה נגררה לאזור הברך כדי לחשוף את FA הדיסטלי. הדמיית תהודה מגנטית (MRI) על גפיים אחוריות דו-צדדיות שימשה לזיהוי חסימה FA לאחר הניתוח. ב 0, 1, 3, 5, ו 7 ימים לאחר הניתוח, התאוששות תפקודית של הגפיים האחוריות הוערך חזותית ודורג באמצעות סולם Tarlov. הערכה היסטולוגית בוצעה לאחר המתת חסד של בעלי החיים 7 ימים לאחר DLFA. ההליכים בוצעו בהצלחה ברגל ימין בעשרה עכברים ApoE-/-, ואף עכבר לא מת במהלך התצפית שלאחר מכן. גדלי החתירה בכל 10 העכברים היו פחות מ 5 מ”מ (4.2 ± 0.63 מ”מ). תוצאות ה-MRI הראו כי זרימת הדם של FA בצד האיסכמי נחסמה בבירור. תוצאות סולם Tarlov הראו כי תפקוד הגפיים האחוריות ירד באופן משמעותי לאחר ההליך ולאט לאט התאושש במהלך 7 הימים הבאים. הערכה היסטולוגית הראתה תגובה דלקתית משמעותית בצד האיסכמי וצפיפות מיקרו וסקולרית מופחתת בגפה האחורית האיסכמית. לסיכום, מחקר זה מציג טכניקה שונה באמצעות פירוק מיניאטורי כדי לבצע איסכמיה איבר אחורי (HLI) באמצעות DLFA.

Introduction

יש צורך ללא מענה במודלים פרה-אקליניים של בעלי חיים למחקר במחלות כלי דם כגון מחלת עורקים היקפיים (PAD). למרות ההתפתחויות המתקדמות באבחון ובטיפול, היו יותר מ -200 מיליון חולים עם PAD בשנת2018 1, ומספרם גדל כל הזמן. למרות כמה גישות טיפוליות חדשניות2,3,4,5,6,7 תוארו, תרגום מוצלח של שיטות טיפוליות אלה ליישום קליני נשאר משימה מרתיעה. לכן, מודלים ניסיוניים אמינים ורלוונטיים ב- vivo המדמים את מצב המחלה האנושית נדרשים לחקור את המנגנון הפוטנציאלי והיעילות של גישות טיפוליות חדשות אלה לטיפול PAD6,7.

היפרליפידמיה וטרשת עורקים (AS) הם גורמי הסיכון העיקריים להתפתחות PAD. ApoE-/- עכברים (על דיאטה עתירת שומן) להציג חילוף חומרים שומן חריג היפרליפידמיה ולאחר מכן לפתח לוחותthertherosclerotic עיבוד ApoE-/- עכברים כבחירה הטובה ביותר לדמות PAD רלוונטי קלינית. מודלים פרה-אקליניים של בעלי חיים HLI נוצרים באמצעות קשירה כפולה של עורק הירך (DLFA), שהיא הגישה הנפוצה ביותר במעבדות בכל רחבי העולם8,9,10,11,12,13,14,15 כדי לדמות איסכמיה חריפה על כרונית. עם זאת, גישה זו דורשת בדרך כלל נתק גדול ו פולשני יחסית. יתר על כן, זה מוביל בהכרח לבעלי החיים (במיוחד עכברים) הסובלים מפגיעה מוגברת בכאב ודלקת, אשר משפיע גם על התוצאות הניסיוניות הבאות5,6,16,17. מאמר זה מתאר מודל HLI חריף על כרוני ב- APOE-/- עכברים באמצעות חבטה קטנה מאוד.

Protocol

הערה: כל ההליכים הניסיוניים בוצעו על פי הנחיה EC EC 2010/63/EU ואושרו על ידי החקיקה הגרמנית המקומית (35-9185.81/G[1]239/18). עשרה עכברים זכרים ApoE-/- עם רקע C57BL /6J, במשקל 29.6-38.0 גרם, שוכנו על מחזור בהיר /כהה 12 שעות והאכילו דיאטה מערבית (1.25% כולסטרול ו -21% שומן) ומים ad libitum במשך 12 שבועות מגיל 8 שבועות. HLI בוצע …

Representative Results

מאפיינים של ApoE-/- עכבריםניתוחי DLFA בוצעו בהצלחה על 10 עכברים כדי להקים את מודל HLI, ואף אחד מהעכברים לא מת לאחר ההליך. כדי לעקוב אחר שינויים במשקל הגוף, עכברים נשקלו לפני הליך DLFA (Pre-DLFA) ו 7 ימים לאחר ניתוח DLFA (לאחר DLFA). משקלי Pre-DLFA נעו בין 29.6 ל-38.0 גרם (ממוצע 34.74 ± 2.47 …

Discussion

מחקר זה מדווח על גישה שונה, פשוטה ויעילה בניתוח כדי להקים מודל HLI ב- ApoE-/- עכברים באמצעות קשירה כפולה באזורים הפרוקסימליים והדיסטליים של ה- FA באמצעות חתך של 3-4 מ”מ ללא כל שדרוגי מעבדה נדרשים. המאפיין העיקרי של שיטה זו הוא הגודל הקטן יותר של ההסתה בהשוואה למחקרים שדווחו בעבר המתארים מודלי…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים לויקוריה סקודה, אלכסנדר שלונד ופליקס הרנר על התמיכה הטכנית המצוינת.

Materials

10x Phosphate buffer saline Roth 9143.1 Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
30% H2O2 Roth 9681.2 Used for immunohistochemistry stain
6-0 absorbable sutures PROLENE 8776H Used for stitching the skin
6-0 absroable suture PROLENE EP8706 Used in Surgery
7-0 absorbable sutures PROLENE EH8021E Used for ligating the artery
7-0 absroable suture PROLENE EP8755 Used in Surgery
Acetic acid Roth 6755.1 Used for haematoxylin and eosin stain
Albumin Fraktion V Roth 8076.2 Used for immunohistochemistry stain
Autoclave Systec GmbH Systec VX-150 Used for the sterilisation of the surgical instruments
Axio vert A1 microscope Carl Zeiss ZEISS Axio Vert.A1 Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
Bruker BioSpec 94/20 AVIII Bruker Biospin MRI GmbH N/A Scan the femoral artery blockage
Buprenovet Sine 0,3mg/ml Bayer AG 2542 (WDT) Used in post operative pain-management. Dose – 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation
CD31 antibody Abcam ab28364 Used for immunohistochemistry stain
Eosin Y solution 0.5 % in water Roth X883.1 Used for haematoxylin and eosin stain
Epitope Retrieval Solution pH 6 Leica Biosystems 6046945 Used for immunohistochemistry stain
Ethanol ≥ 99,5 % Roth 5054.1 Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
Fentanyl Cayman Chemical 437-38-7 Used for anesthesia
Fine point forceps Medixplus 93-4505S Used for separating the artery from nerve and vein
Glass bead sterilisator Simon Keller Type 250 Used for sterilisation of the surgical instruments
Graefe iris forceps curved VUBU VUBU-02-72207 Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue
Hair Remover cream, Veet (with aloe vera) Reckitt Benckiser 108972 Remove hair from mice hind limbs
Heating plate STÖRK-TRONIC 7042092 Keep the satble temperature of mice
Hematoxylin Roth T865.2 Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
Leica surgical microscope Leica M651 Enlarge the field of view to facilitate the operation
Liquid DAB+Substrate Chromogen System Dako K3468 Used for immunohistochemistry stain
Male ApoE-/- mice Charles River Laboratories N/A Used for establish the Peripheral artery disease mice model
Medetomidine Cayman Chemical 128366-50-7 Used for anesthesia
Micro Needle Holder Black & Black Surgical B3B-18-8 Holding the needle
Micro suture tying forceps Life Saver Surgical Industries PS-MSF-145 Used to assist in knotting during surgery
Microtome Biobase Bk-Mt268m Used for tissue sectioning
Midazolam Ratiopharm 44856.01.00 Used for anesthesia
MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025 SA Instruments N/a monitoring vital signs of animal during MRI scan
Octeniderm farblos Schülke & Mayr GmbH 180212 used for disinfection of the skin
Ointment for the eyes and nose Bayer AG 1578675 Keep the eyes wet under the anesthesia
Paraformaldehyde Roth 0335.1 Used for fixation of the tissue
Pentobarbital Nembutal 76-74-4 Used for anesthesia
Saline DeltaSelect 1299.99.99 Used for anesthesia
Spring handle scissors with fine, sharp tips Black & Black Surgical B66167 Used for cutting the artery
SuperCut Scissors Black & Black Surgical B55992 Used for cutting the skin
Triton X-100 Roth 9002-93-1 Used for immunohistochemistry stain
Western diet, 1.25% Cholesterol ssniff Spezialdiäten GmbH E15723-34 Diet for the mice
Xylene Roth 4436.3 Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shu, J., Santulli, G. Update on peripheral artery disease: Epidemiology and evidence-based facts. Atherosclerosis. 275, 379-381 (2018).
  2. Tateishi-Yuyama, E., et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet. 360 (9331), 427-435 (2002).
  3. Wang, Z. X., et al. Efficacy of autologous bone marrow mononuclear cell therapy in patients with peripheral arterial disease. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 21 (11), 1183-1196 (2014).
  4. Botham, C. M., Bennett, W. L., Cooke, J. P. Clinical trials of adult stem cell therapy for peripheral artery disease. Methodist Debakey Cardiovascular Journal. 9 (4), 201-205 (2013).
  5. van Weel, V., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression in ischemic skeletal muscle enhances myoglobin expression in vivo. Circulation Research. 95 (1), 58-66 (2004).
  6. Olea, F. D., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression does not enhance adipose stromal cell-induced protection on muscle damage in critical limb ischemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (1), 184-188 (2015).
  7. Peeters Weem, S. M. O., Teraa, M., de Borst, G. J., Verhaar, M. C., Moll, F. L. Bone marrow derived cell therapy in critical limb ischemia: a meta-analysis of randomized placebo controlled trials. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 50 (6), 775-783 (2015).
  8. Crawford, R. S., et al. Divergent systemic and local inflammatory response to hind limb demand ischemia in wild-type and ApoE-/- mice. Journal of Surgical Research. 183 (2), 952-962 (2013).
  9. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e1035 (2009).
  10. Brenes, R. A., et al. Toward a mouse model of hind limb ischemia to test therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular Surgery. 56 (6), 1669-1679 (2012).
  11. Peck, M. A., et al. A functional murine model of hindlimb demand ischemia. Annals of Vascular Surgery. 24 (4), 532-537 (2010).
  12. Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
  13. Nagase, H., Yao, S., Ikeda, S. Acute and chronic effects of exercise on mRNA expression in the skeletal muscle of two mouse models of peripheral artery disease. PLoS One. 12 (8), 0182456 (2017).
  14. Fu, J., et al. Hydrogen molecules (H2) improve perfusion recovery via antioxidant effects in experimental peripheral arterial disease. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 5009-5015 (2018).
  15. Yu, J., Dardik, A. A murine model of hind limb ischemia to study angiogenesis and arteriogenesis. Methods in Molecular Biology. 1717, 135-143 (2018).
  16. Pu, L. Q., et al. Enhanced revascularization of the ischemic limb by angiogenic therapy. Circulation. 88 (1), 208-215 (1993).
  17. Takeshita, S., et al. Therapeutic angiogenesis. A single intraarterial bolus of vascular endothelial growth factor augments revascularization in a rabbit ischemic hind limb model. Journal of Clinical Investigation. 93 (2), 662-670 (1994).
  18. Tarlov, I. M. Spinal cord compression studies. III. Time limits for recovery after gradual compression in dogs. AMA Archives of Neurology and Psychiatry. 71 (5), 588-597 (1954).
  19. Westvik, T. S., et al. Limb ischemia after iliac ligation in aged mice stimulates angiogenesis without arteriogenesis. Journal of Vascular Surgery. 49 (2), 464-473 (2009).
  20. Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
  21. Liu, Q., et al. CRISPR/Cas9-mediated hypoxia inducible factor-1α knockout enhances the antitumor effect of transarterial embolization in hepatocellular carcinoma. Oncology Reports. 40 (5), 2547-2557 (2018).
  22. Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).
  23. Pellegrin, M., et al. Experimental peripheral arterial disease: new insights into muscle glucose uptake, macrophage, and T-cell polarization during early and late stages. Physiological Reports. 2 (2), 00234 (2014).
  24. Sun, Z., et al. VEGF-loaded graphene oxide as theranostics for multi-modality imaging-monitored targeting therapeutic angiogenesis of ischemic muscle. Nanoscale. 5 (15), 6857-6866 (2013).
  25. Craige, S. M., et al. NADPH oxidase 4 promotes endothelial angiogenesis through endothelial nitric oxide synthase activation. Circulation. 124 (6), 731-740 (2011).
  26. Kant, S., et al. Neural JNK3 regulates blood flow recovery after hindlimb ischemia in mice via an Egr1/Creb1 axis. Nature Communications. 10 (1), 4223 (2019).
  27. Chevalier, J., et al. Obstruction of small arterioles in patients with critical limb ischemia due to partial endothelial-to-mesenchymal transition. iScience. 23 (6), 101251 (2020).
  28. Kosmac, K., et al. Correlations of calf muscle macrophage content with muscle properties and walking performance in peripheral artery disease. Journal of the American Heart Association. 9 (10), 015929 (2020).
  29. Mohiuddin, M., et al. Critical limb ischemia induces remodeling of skeletal muscle motor unit, myonuclear-, and mitochondrial-domains. Scientific Reports. 9 (1), 9551 (2019).
  30. Ministro, A., et al. Assessing therapeutic angiogenesis in a murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59582 (2019).
  31. Kilarski, W. W., Samolov, B., Petersson, L., Kvanta, A., Gerwins, P. Biomechanical regulation of blood vessel growth during tissue vascularization. Nature Medicine. 15 (6), 657-664 (2009).
  32. Portou, M. J., et al. Hyperglycaemia and ischaemia impair wound healing via Toll-like receptor 4 pathway activation in vitro and in an experimental murine model. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 59 (1), 117-127 (2020).
  33. Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
  34. Hazarika, S., et al. MicroRNA-93 controls perfusion recovery after hindlimb ischemia by modulating expression of multiple genes in the cell cycle pathway. Circulation. 127 (17), 1818-1828 (2013).
  35. Fan, W., et al. mTORC1 and mTORC2 play different roles in the functional survival of transplanted adipose-derived stromal cells in hind limb ischemic mice via regulating inflammation in vivo. Stem Cells. 31 (1), 203-214 (2013).
  36. Terry, T., et al. CD34(+)/M-cadherin(+) bone marrow progenitor cells promote arteriogenesis in ischemic hindlimbs of ApoE(-)/(-) mice. PLoS One. 6 (6), 20673 (2011).
  37. Kwee, B. J., et al. Treating ischemia via recruitment of antigen-specific T cells. Science Advances. 5 (7), (2019).
  38. Nakada, M. T., et al. Clot lysis in a primate model of peripheral arterial occlusive disease with use of systemic or intraarterial reteplase: addition of abciximab results in improved vessel reperfusion. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 15 (2), 169-176 (2004).
  39. Carr, A. N., et al. Efficacy of systemic administration of SDF-1 in a model of vascular insufficiency: support for an endothelium-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 69 (4), 925-935 (2006).
  40. Del Giudice, C., et al. Evaluation of a new model of hind limb ischemia in rabbits. Journal of Vascular Surgery. 68 (3), 849-857 (2018).
  41. Liddell, R. P., et al. Endovascular model of rabbit hindlimb ischemia: a platform to evaluate therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 16 (7), 991-998 (2005).
  42. Aboyans, V., et al. 2017 ESC guidelines on the diagnosis and treatment of peripheral arterial diseases, in collaboration with the European Society for Vascular Surgery (ESVS): Document covering atherosclerotic disease of extracranial carotid and vertebral, mesenteric, renal, upper and lower extremity arteriesEndorsed by: the European Stroke Organization (ESO)The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Peripheral Arterial Diseases of the European Society of Cardiology (ESC) and of the European Society for Vascular Surgery (ESVS). European Heart Journal. 39 (9), 763-816 (2018).
  43. Lo Sasso, G., et al. The Apoe(-/-) mouse model: a suitable model to study cardiovascular and respiratory diseases in the context of cigarette smoke exposure and harm reduction. Journal of Translational Medicine. 14 (1), 146 (2016).

Tags

Keywords: Hind Limb IschemiaApoE-/- MiceModified Surgical ModelMiniature IncisionLow InvasivenessInguinal RegionFemoral ArteryFemoral NerveFemoral VeinAbsorbable SuturesNeurovascular BundleMicrosurgical Model
check_url/kr/62402?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Yan, K., Zheng, J., Zöllner, F. G., Schwenke, K., Pallavi, P., Keese, M. A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision. J. Vis. Exp. (171), e62402, doi:10.3791/62402 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image