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생물학

Um modelo cirúrgico modificado de isquemia de membros traseiros em ApoE-/- Ratos usando uma incisão em miniatura

Published: May 13, 2021
doi:
10.3791/62402
, , , , ,
1Department of Surgery, Medical Faculty Manheim,Heidelberg University, 2European Center of Angioscience ECAS, Medical Faculty Manheim,Heidelberg University, 3Computer-Assisted Clinical Medicine, Mannheim Institute for Intelligent Systems in Medicine, Medical Faculty Mannheim,Heidelberg University, 4Cooperative Core Facility Animal Scanner ZI, Medical Faculty Mannheim,Heidelberg University

Summary

Este artigo demonstra uma abordagem cirúrgica eficiente para estabelecer isquemia aguda em camundongos com uma pequena incisão. Essa abordagem pode ser aplicada pela maioria dos grupos de pesquisa sem quaisquer atualizações laboratoriais.

Abstract

O objetivo deste estudo é introduzir e avaliar uma abordagem cirúrgica modificada para induzir isquemia aguda em camundongos que podem ser implementados na maioria dos laboratórios animais. Ao contrário da abordagem convencional para a dupla ligadura da artéria femoral (DLFA), foi feita uma incisão menor na região inguinal direita para expor a artéria femoral proximal (FA) para a realização de DLFA. Em seguida, utilizando uma sutura 7-0, a incisão foi arrastada para a região do joelho para expor a ressonância magnética distal (RM) em membros traseiros bilaterais foi usada para detectar oclusão da FA após a cirurgia. Aos 0, 1, 3, 5 e 7 dias após a cirurgia, a recuperação funcional dos membros posteriores foi avaliada visualmente e avaliada por meio da escala de Tarlov. A avaliação histológica foi realizada após eutanásia dos animais 7 dias após a DLFA. Os procedimentos foram realizados com sucesso na perna direita em dez ApoE-/- camundongos, e nenhum camundongo morreu durante observação subsequente. Os tamanhos de incisão em todos os 10 camundongos foram inferiores a 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). Os resultados da ressonância mostraram que o fluxo sanguíneo da FA no lado isquêmico estava claramente bloqueado. Os resultados da escala tarlov demonstraram que a função do membro traseiro diminuiu significativamente após o procedimento e se recuperou lentamente nos 7 dias seguintes. A avaliação histólógica mostrou uma resposta inflamatória significativa no lado isquêmico e reduziu a densidade microvascular no membro traseiro isquêmico. Em conclusão, este estudo introduz uma técnica modificada usando uma incisão em miniatura para realizar isquemia de membros traseiros (HLI) utilizando DLFA.

Introduction

Há necessidade não atendida de modelos animais pré-clínicos para pesquisas em doenças vasculares, como a doença arterial periférica (PAD). Apesar dos desenvolvimentos avançados no diagnóstico e tratamento, houve mais de 200 milhões de pacientes com PAD em2018 1, e seu número está constantemente aumentando. Embora várias novas abordagens terapêuticas2,3,4,5,6,7 tenham sido descritas, a tradução bem sucedida dessas modalidades terapêuticas para a aplicação clínica continua sendo uma tarefa assustadora. Portanto, modelos experimentais in vivo confiáveis e relevantes que simulam a condição da doença humana são necessários para investigar o mecanismo potencial e a eficiência dessas novas abordagens terapêuticas para tratar o PAD6,7.

Hiperlipidemia e aterosclerose (AS) são os principais fatores de risco para o desenvolvimento do PAD. Os camundongos apoE(em uma dieta rica em gordura) apresentam metabolismo de gordura anormal e hiperlipidemia e, posteriormente, desenvolvem placas ateroscleróticas que tornam a ApoE-/- camundongos como a melhor escolha para simular o PAD clinicamente relevante. Os modelos de animais HLI pré-clínicos são gerados por meio da dupla ligadura da artéria femoral (DLFA), que é a abordagem mais utilizada em laboratórios em todo o mundo8,9,10,11,12,13,14,15 para simular isquemia aguda-on-crônica. No entanto, essa abordagem geralmente requer uma incisão relativamente grande e invasiva. Além disso, inevitavelmente leva os animais (especialmente camundongos) a sofrer de aumento da dor e inflamação, o que também influencia os resultados experimentais subsequentes5,6,16,17. Este artigo descreve um modelo HLI agudo-on-crônico em APOE-/- camundongos usando uma incisão muito pequena.

Protocol

NOTA: Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com a diretriz da CE EC 2010/63/UE e foram aprovados pela legislação alemã local (35-9185.81/G[1]239/18). Dez ApoEmasculinos -/- camundongos com fundo C57BL/6J, pesando 29,6-38,0 g, foram alojados em um ciclo claro/escuro de 12 horas e alimentaram uma dieta ocidental (1,25% de colesterol e 21% de gordura) e ad libitum de água por 12 semanas a partir da idade de 8 semanas. O HLI foi realizado em camundongos de 20 semanas de idade…

Representative Results

Características do ApoE-/- ratosAs cirurgias de DLFA foram realizadas com sucesso em 10 camundongos para estabelecer o modelo HLI, e nenhum dos camundongos morreu após o procedimento. Para acompanhar as mudanças no peso corporal, os camundongos foram pesados antes do procedimento DLFA (Pré-DLFA) e 7 dias após a cirurgia de DLFA (Pós-DLFA). Os pesos pré-DLFA variaram de 29,6 a 38,0 g (média de 34,74 ± 2,47 g), e os pesos pós-DLFA variaram de 26.5…

Discussion

Este estudo relata uma abordagem modificada, simplificada e cirurgicamente eficiente para estabelecer um modelo HLI em ApoE-/- camundongos usando ligadura dupla nas regiões proximais e distais da FA através de uma incisão de 3-4 mm sem quaisquer atualizações laboratoriais necessárias. A principal característica deste método é o tamanho menor da incisão em comparação com estudos relatados anteriormente descrevendo os modelos HLI do mouse8,9<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem a Viktoria Skude, Alexander Schlund e Felix Hörner pelo excelente apoio técnico.

Materials

10x Phosphate buffer saline Roth 9143.1 Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
30% H2O2 Roth 9681.2 Used for immunohistochemistry stain
6-0 absorbable sutures PROLENE 8776H Used for stitching the skin
6-0 absroable suture PROLENE EP8706 Used in Surgery
7-0 absorbable sutures PROLENE EH8021E Used for ligating the artery
7-0 absroable suture PROLENE EP8755 Used in Surgery
Acetic acid Roth 6755.1 Used for haematoxylin and eosin stain
Albumin Fraktion V Roth 8076.2 Used for immunohistochemistry stain
Autoclave Systec GmbH Systec VX-150 Used for the sterilisation of the surgical instruments
Axio vert A1 microscope Carl Zeiss ZEISS Axio Vert.A1 Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
Bruker BioSpec 94/20 AVIII Bruker Biospin MRI GmbH N/A Scan the femoral artery blockage
Buprenovet Sine 0,3mg/ml Bayer AG 2542 (WDT) Used in post operative pain-management. Dose – 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation
CD31 antibody Abcam ab28364 Used for immunohistochemistry stain
Eosin Y solution 0.5 % in water Roth X883.1 Used for haematoxylin and eosin stain
Epitope Retrieval Solution pH 6 Leica Biosystems 6046945 Used for immunohistochemistry stain
Ethanol ≥ 99,5 % Roth 5054.1 Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
Fentanyl Cayman Chemical 437-38-7 Used for anesthesia
Fine point forceps Medixplus 93-4505S Used for separating the artery from nerve and vein
Glass bead sterilisator Simon Keller Type 250 Used for sterilisation of the surgical instruments
Graefe iris forceps curved VUBU VUBU-02-72207 Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue
Hair Remover cream, Veet (with aloe vera) Reckitt Benckiser 108972 Remove hair from mice hind limbs
Heating plate STÖRK-TRONIC 7042092 Keep the satble temperature of mice
Hematoxylin Roth T865.2 Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
Leica surgical microscope Leica M651 Enlarge the field of view to facilitate the operation
Liquid DAB+Substrate Chromogen System Dako K3468 Used for immunohistochemistry stain
Male ApoE-/- mice Charles River Laboratories N/A Used for establish the Peripheral artery disease mice model
Medetomidine Cayman Chemical 128366-50-7 Used for anesthesia
Micro Needle Holder Black & Black Surgical B3B-18-8 Holding the needle
Micro suture tying forceps Life Saver Surgical Industries PS-MSF-145 Used to assist in knotting during surgery
Microtome Biobase Bk-Mt268m Used for tissue sectioning
Midazolam Ratiopharm 44856.01.00 Used for anesthesia
MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025 SA Instruments N/a monitoring vital signs of animal during MRI scan
Octeniderm farblos Schülke & Mayr GmbH 180212 used for disinfection of the skin
Ointment for the eyes and nose Bayer AG 1578675 Keep the eyes wet under the anesthesia
Paraformaldehyde Roth 0335.1 Used for fixation of the tissue
Pentobarbital Nembutal 76-74-4 Used for anesthesia
Saline DeltaSelect 1299.99.99 Used for anesthesia
Spring handle scissors with fine, sharp tips Black & Black Surgical B66167 Used for cutting the artery
SuperCut Scissors Black & Black Surgical B55992 Used for cutting the skin
Triton X-100 Roth 9002-93-1 Used for immunohistochemistry stain
Western diet, 1.25% Cholesterol ssniff Spezialdiäten GmbH E15723-34 Diet for the mice
Xylene Roth 4436.3 Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain
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Keywords: Hind Limb IschemiaApoE-/- MiceModified Surgical ModelMiniature IncisionLow InvasivenessInguinal RegionFemoral ArteryFemoral NerveFemoral VeinAbsorbable SuturesNeurovascular BundleMicrosurgical Model
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Yan, K., Zheng, J., Zöllner, F. G., Schwenke, K., Pallavi, P., Keese, M. A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision. J. Vis. Exp. (171), e62402, doi:10.3791/62402 (2021).
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