Zebravismodel van neuroblastoommetastase
Summary
Dit artikel introduceert de methode voor het ontwikkelen, karakteriseren en volgen in real-time van de tumormetastase in het zebravismodel van neuroblastoom, met name in de transgene zebravislijn met overexpressie van MYCN en LMO1, die spontaan metastase ontwikkelt.
Abstract
Zebravis is naar voren gekomen als een belangrijk diermodel om menselijke ziekten, met name kanker, te bestuderen. Samen met de robuuste transgene en genoombewerkingstechnologieën die worden toegepast bij zebravismodellering, maken het onderhoudsgemak, de productiviteit met hoge opbrengst en krachtige live beeldvorming de zebravis een waardevol modelsysteem om metastase en cellulaire en moleculaire bases te bestuderen die ten grondslag liggen aan dit proces in vivo. Het eerste zebravis neuroblastoom (NB) model van metastase werd ontwikkeld door overexpressie van twee oncogenen, MYCN en LMO1, onder controle van de dopamine-beta-hydroxylase (dβh) promotor. Co-overexpressie van MYCN en LMO1 leidde tot de verminderde latentie en verhoogde penetrantie van neuroblastomagenese, evenals versnelde metastase op afstand van tumorcellen. Dit nieuwe model herhaalt op betrouwbare wijze veel belangrijke kenmerken van human metastatische NB, waaronder betrokkenheid van klinisch relevante en metastase-geassocieerde genetische veranderingen; natuurlijke en spontane ontwikkeling van metastase in vivo; en geconserveerde plaatsen van metastasen. Daarom heeft het zebravismodel unieke voordelen om het complexe proces van tumormetastase in vivo te ontleden.
Introduction
Zebravis is op grote schaal gebruikt en toegepast op verschillende onderzoeksgebieden, vooral bij kanker. Dit model biedt vele voordelen – zoals de robuuste reproductie, kosteneffectief onderhoud en veelzijdige visualisatie van tumorgroei en metastase – die zebravissen allemaal een krachtig hulpmiddel maken om de cellulaire en moleculaire bases van tumorigenese en metastase te bestuderen en te onderzoeken. Nieuwe technieken voor grootschalige genoomkartering, transgenese, overexpressie of knock-out van genen, celtransplantatie en chemische schermen hebben de kracht van het zebravismodel enorm vergroot1. In de afgelopen jaren zijn veel zebravislijnen ontwikkeld om tumorigenese en metastase van een verscheidenheid aan menselijke kankers te bestuderen, waaronder maar niet beperkt tot leukemie, melanoom, rabdomyosarcoom en hepatocellulair carcinoom2,3,4,5. Bovendien werd het eerste zebravismodel van neuroblastoom (NB) gegenereerd door overexpressie van MYCN, een oncogen, in het perifere sympathische zenuwstelsel (PSNS) onder controle van de dopamine-bèta-hydroxylase (dβh) promotor. Met dit model werd verder aangetoond dat geactiveerde ALK kan samenwerken met MYCN om het begin van de tumor te versnellen en de tumorpenetratie in vivo6 te verhogen.
NB is afgeleid van de sympathoadrenale afstamming van de neurale kamcellen en is een sterk gemetastaseerde kanker bij kinderen7. Het is verantwoordelijk voor 10% van de pediatrische kankergerelateerde sterfgevallen8. Nb is op grote schaal uitgezaaid bij de diagnose en kan klinisch worden gepresenteerd als tumoren die voornamelijk afkomstig zijn langs de keten van de sympathische ganglia en het bijniermerg van PSNS9,10. MYCN-amplificatie wordt vaak geassocieerd met slechte resultaten bij NB-patiënten11,12. Bovendien is LMO1 geïdentificeerd als een kritisch NB-gevoeligheidsgen in gevallen met een hoog risico13,14. Studies hebben aangetoond dat de transgene coexpressie van MYCN en LMO1 in het PSNS van het zebravismodel niet alleen een eerder begin van NB bevordert, maar ook wijdverspreide metastase induceert voor de weefsels en organen die vergelijkbaar zijn met plaatsen die vaak worden gezien bij patiënten met een hoog risico NB13. Zeer recent is een ander gemetastaseerd fenotype van NB ook waargenomen in een nieuwer zebravismodel van NB, waarin zowel MYCN als Lin28B, coderend voor een RNA-bindend eiwit, overexpressie hebben onder controle van de dβh-promotor16.
De stabiele transgene benadering bij zebravissen wordt vaak gebruikt om te bestuderen of overexpressie van een interessant gen kan bijdragen aan de normale ontwikkeling en ziektepathogenese14,15. Deze techniek is met succes gebruikt om het belang van meerdere genen en routes naar NB tumorigenese6,16,17,18,19,20 aan te tonen. Dit artikel zal introduceren hoe de transgene vislijn die zowel MYCN als LMO1 in het PSNS overexpresseert, werd gecreëerd en hoe werd aangetoond dat de samenwerking van deze twee oncogenen het begin van NB-tumorigenese en metastase versnelt13. Ten eerste werd de transgene lijn die EGFP-MYCN onder controle van de dβh-promotor (aangeduid als MYCN-lijn) overexpressie geeft, ontwikkeld door de dβh-EGFP-MYCN-constructie te injecteren in eencellig stadium van wild-type (WT) AB-embryo’s, zoals eerder beschreven6,17. Een afzonderlijke transgene lijn die LMO1 overexpressie geeft in de PSNS (aangeduid als LMO1-lijn) werd ontwikkeld door twee DNA-constructen, dβh-LMO1 en dβh-mCherry, samen te voegen in WT-embryo’s in het eencellige stadium13. Eerder is aangetoond dat co-geïnjecteerde dubbele DNA-constructies kunnen worden gecoïntegreerd in het visgenoom; daarom worden LMO1 en mCherry co-expressie gebracht in de PSNS-cellen van de transgene dieren. Zodra de geïnjecteerde F0-embryo’s geslachtsrijp waren, werden ze vervolgens gekruist met WT-vissen voor de identificatie van positieve vissen met transgen (s) integratie. Kortom, de F1-nakomelingen werden eerst gescreend door fluorescerende microscopie op mCherry-expressie in de PSNS-cellen. De kiembaanintegratie van LMO1 in mCherry-positieve vissen werd verder bevestigd door genomische PCR en sequencing. Na succesvolle identificatie van elke transgene lijn werden de nakomelingen van heterozygote MYCN– en LMO1-transgene vissen gekruist om een samengestelde vislijn te genereren die zowel MYCN als LMO1 (aangeduid als MYCN; LMO1 lijn). Tumordragende MYCN; LMO1-vissen werden tweewekelijks door fluorescerende microscopie gecontroleerd op het bewijs van gemetastaseerde tumoren in de regio’s ver weg van de primaire locatie, interrenaal kliergebied (IRG, zebravisequivalent van menselijke bijnier)13. Om de metastase van tumoren in MYCN te bevestigen; LMO1-vis, histologische en immunohistochemische analyses werden toegepast.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebravis is de afgelopen decennia vaak gebruikt in onderzoek, vooral in kankeronderzoek, om voor de hand liggende redenen, zoals het onderhoudsgemak, robuuste reproductie en duidelijke voordelen voor in vivo beeldvorming1,28. Het zebravismodel kan gemakkelijk embryonaal worden gemanipuleerd vanwege hun externe bevruchting en ontwikkeling, die goed complementair is aan zoogdiermodelorganismen, zoals ratten en muizen, voor grootschalige genetische <sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een subsidie R01 CA240323 (S.Z.) van het National Cancer Institute; een subsidie W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) van het Amerikaanse ministerie van Defensie (DoD); een V Scholar award van de V Foundation for Cancer Research (S.Z.) en een Platform Grant van het Mayo Center for Biomedical Discovery (S.Z.); en ondersteuning van het Mayo Clinic Cancer Center en Center for Individualized Medicine (S.Z.).
Materials
| 3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit | Vector | SK-4100 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific / Acros Organic | 64-19-7 | |
| Agarose GP2 | Midwest Scientific | 009012-36-6 | |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Pel-Freez | P40101 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| BOND Intense R Detection | Leica Biosystems | DS9263 | |
| BOND primary antibody diluent | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | AR9352 | |
| BOND-MAX IHC instrument | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | N/A | fully automated IHC staining system |
| CH211-270H11 BAC clone | BACPAC resources center (BRFC) | N/A | |
| Compound microscope equipped with DP71 camera | Olympus | AX70 | |
| Cytoseal XYL (xylene based mounting medium) | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Eosin | Leica | 3801601 | ready-to-use (no preparation needed) |
| Ethanol | Carolina | 86-1263 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
| Gateway BP Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-100 | |
| Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated) | Dako | E0432 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | HHS-32-1L | |
| HRP Avidin D | Vector | A-2004 | |
| Hydrochloric Acid | Aqua Solutions | 4360-1L | |
| Hydrogen Peroxide, 3% | Fisher Scientific | H324-500 | |
| I-SceI enzyme | New England Biolabs, MA | R0694L | |
| Kanamycin sulfate | Teknova, Inc. | K2150 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 34133 | |
| Lithium Carbonate | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
| Microtome for sectioning | Leica Biosystems | RM2255 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| p3E-polyA | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.) |
| Parafin wax | Surgipath Paraplast | 39603002 | Parrafin to parafin |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 | |
| pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites) | Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany | N/A | a generous gift |
| pDONR 221 gateway donor vector | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
| pDONRP4-P1R donor vector | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift |
| Phenol red, 0.5% | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X | BioRad | 1610780 | |
| Picrosirrius red stain kit | Polysciences | 24901-250 | |
| pME-mCherry | Addgene | 26028 | (DBH construct) |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Roche | 21712520 | |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| RDO Rapid Decalcifier | Apex Enginerring | RDO04 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
| Stereo fluorescence microscope | Leica | MZ10F | |
| Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging | Nikon | SMZ-1500 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs, MA | M0273L | |
| Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor | Sakura | N/A | Model #: VIP-6-A1 |
| Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
| Xylene | Thermo Fisher Scientific | X3P1GAL |
References
- Veldman, M., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Research. 6 (5), 694 (2008).
- Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2010).
- Benjamin, D. C., Hynes, R. O. Intravital imaging of metastasis in adult Zebrafish. BMC Cancer. 17 (1), 660 (2017).
- Kim, I. S., et al. Microenvironment-derived factors driving metastatic plasticity in melanoma. Nature Communications. 8, 14343 (2017).
- Zhu, S., et al. Activated ALK collaborates with MYCN in neuroblastoma pathogenesis. Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).
- Maris, J. M., Hogarty, M. D., Bagatell, R., Cohn, S. L. Neuroblastoma. Lancet. 369 (9579), 2106-2120 (2007).
- Park, J. R., et al. Children’s oncology group’s 2013 blueprint for research: neuroblastoma. Pediatric Blood and Cancer. 60 (6), 985-993 (2013).
- Hoehner, J. C., et al. A developmental model of neuroblastoma: differentiating stroma-poor tumors’ progress along an extra-adrenal chromaffin lineage. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 75 (5), 659-675 (1996).
- Tsubota, S., Kadomatsu, K. Origin and initiation mechanisms of neuroblastoma. Cell and Tissue Research. 372 (2), 211-221 (2018).
- Tolbert, V. P., Matthay, K. K. Neuroblastoma: Clinical and biological approach to risk stratification and treatment. Cell and Tissue Research. 372 (2), 195-209 (2018).
- Maris, J. M. Recent advances in neuroblastoma. New England Journal of Medicine. 362 (23), 2202-2211 (2010).
- Zhu, S., et al. LMO1 Synergizes with MYCN to promote neuroblastoma initiation and metastasis. Cancer Cell. 32, 310-323 (2017).
- Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Tao, T., et al. LIN28B regulates transcription and potentiates MYCN-induced neuroblastoma through binding to ZNF143 at target gene promotors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (28), 16516-16526 (2020).
- Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (97), e52567 (2015).
- Zhang, X., et al. Critical role for GAB2 in neuroblastoma pathogenesis through the promotion of SHP2/MYCN cooperation. Cell Reports. 18 (12), 2932-2942 (2017).
- Zimmerman, M. W., et al. MYC drives a subset of high-risk pediatric neuroblastomas and is activated through mechanisms including enhancer hijacking and focal enhancer amplification. Cancer Discovery. 8 (3), 320-335 (2018).
- Koach, J., et al. Drugging MYCN oncogenic signaling through the MYCN-PA2G4 binding interface. 암 연구학. 79 (21), 5652-5667 (2019).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- DuBois, S. G., et al. Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival. Journal of pediatric hematology/oncology. 21 (3), 181-189 (1999).
- Wattrus, S. J., Zon, L. I. Stem cell safe harbor: The hematopoietic stem cell niche in zebrafish. Blood Advances. 2 (21), 3063-3069 (2018).
- Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicologic Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: Zebrafish and vertebrate immunity. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
- Junqueira, L. C., Cossermelli, W., Brentani, R. Differential staining of collagens type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy. Archivum histologicum Japonicum (Nihon Soshikigaku Kiroku). 41 (3), 267-274 (1978).
- Sweat, F., Puchtler, H., Rosenthal, S. I. Sirius red F3BA as a stain for connective tissue. Archives of Pathology. 78, 69-72 (1964).
- Ignatius, M. S., Hayes, M., Langenau, D. M. In vivo imaging of cancer in zebrafish. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 219-237 (2016).
- Howe, C. K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 20 (5), 263-273 (2020).
- Yoganantharjah, P., Gibert, Y. The Use of the zebrafish model to aid in drug discovery and target validation. Current Topics in Medicinal Chemistry. 17 (18), 2041-2055 (2018).
- Ignatius, M. S., et al. In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 21 (5), 680-693 (2012).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Ahmed, S., et al. Neuroblastoma with orbital metastasis: ophthalmic presentation and role of ophthalmologists. Eye. 20 (4), 466-470 (2006).
- Papaioannou, G., McHugh, K. Neuroblastoma in childhood: review and radiological findings. Cancer Imaging Society. 5 (1), 116-127 (2005).
- Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
- Amores, A., et al. Zebrafish hox clusters and vertebrate genome evolution. Science. 282 (5394), 1711-1714 (1998).
- Postlethwait, J. H., et al. Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map. Nature Genetics. 18 (4), 345-349 (1998).
- Opazo, J. C., et al. Whole-genome duplication and the functional diversification of teleost fish hemoglobins. Molecular Biology and Evolution. 30 (1), 140-153 (2013).
