Zebrafish Modello di Metastasi del Neuroblastoma
Summary
Questo documento introduce il metodo per sviluppare, caratterizzare e tracciare in tempo reale le metastasi tumorali nel modello di neuroblastoma zebrafish, in particolare nella linea transgenica zebrafish con sovraespressione di MYCN e LMO1, che sviluppa metastasi spontaneamente.
Abstract
Il pesce zebra è emerso come un importante modello animale per studiare le malattie umane, in particolare il cancro. Insieme alle robuste tecnologie transgeniche e di editing del genoma applicate nella modellazione del pesce zebra, la facilità di manutenzione, la produttività ad alto rendimento e la potente imaging dal vivo rendono il pesce zebra un prezioso sistema modello per studiare metastasi e basi cellulari e molecolari alla base di questo processo in vivo. Il primo modello di metastasi del neuroblastoma del pesce zebra (NB) è stato sviluppato sovraesprimendo due oncogeni, MYCN e LMO1, sotto controllo del promotore della dopamina-beta-idrossilasi (dβh). MyCN e LMO1 co-sovraespressi hanno portato alla riduzione della latenza e all’aumento della penetranza della neuroblastomagenesi, nonché all’accelerazione delle metastasi a distanza delle cellule tumorali. Questo nuovo modello ribadisce in modo affidabile molte caratteristiche chiave della NB metastatica umana, incluso il coinvolgimento di alterazioni genetiche clinicamente rilevanti e associate a metastasi; sviluppo naturale e spontaneo di metastasi in vivo; e siti conservati di metastasi. Pertanto, il modello zebrafish possiede vantaggi unici per sezionare il complesso processo di metastasi tumorali in vivo.
Introduction
Zebrafish è stato ampiamente utilizzato e applicato a diverse aree di ricerca, in particolare nel cancro. Questo modello offre molti vantaggi, come la sua riproduzione robusta, la manutenzione economica e la visualizzazione versatile della crescita tumorale e delle metastasi, che rendono il pesce zebra un potente strumento per studiare e studiare le basi cellulari e molecolari della tumorigenesi e delle metastasi. Nuove tecniche per la mappatura del genoma su larga scala, la transgenesi, la sovraespressione o il knockout dei geni, il trapianto di cellule e gli schermi chimici hanno aumentato immensamente la potenza del modello di pesce zebra1. Negli ultimi anni, molte linee di zebrafish sono state sviluppate per studiare la tumorigenesi e le metastasi di una varietà di tumori umani, tra cui, ma non solo, leucemia, melanoma, rabdomiosarcoma e carcinoma epatocellulare2,3,4,5. Inoltre, il primo modello di neuroblastoma (NB) di zebrafish è stato generato sovraesprimendo MYCN, un oncogene, nel sistema nervoso simpatico periferico (PSNS) sotto controllo del promotore della dopamina-beta-idrossilasi (dβh). Con questo modello, è stato ulteriormente dimostrato che l’ALK attivato può sinergizzare con MYCN per accelerare l’insorgenza del tumore e aumentare la penetranza tumorale in vivo6.
NB deriva dal lignaggio simpatico-surrenale delle cellule della cresta neurale ed è un tumore altamente metastatico nei bambini7. È responsabile del 10% dei decessi correlati al cancro pediatrico8. Ampiamente metastatizzato alla diagnosi, l’NB può essere presentato clinicamente come tumori che hanno origine principalmente lungo la catena dei gangli simpatici e del midollo surrenale di PSNS9,10. L’amplificazione di MYCN è comunemente associata a scarsi esiti nei pazienti nb11,12. Inoltre, LMO1 è stato identificato come un gene critico di suscettibilità NB nei casi ad alto rischio13,14. Gli studi hanno scoperto che la coespressione transgenica di MYCN e LMO1 nel PSNS del modello zebrafish non solo promuove l’insorgenza precoce di NB, ma induce anche metastasi diffuse ai tessuti e agli organi che sono simili ai siti comunemente osservati nei pazienti con NB13 ad alto rischio. Molto recentemente, un altro fenotipo metastatico di NB è stato osservato anche in un nuovo modello di zebrafish di NB, in cui sia MYCN che Lin28B, che codificano per una proteina legante l’RNA, sono sovraespressi sotto controllo del promotore dβh16.
L’approccio transgenico stabile nel pesce zebra è spesso usato per studiare se la sovraespressione di un gene di interesse potrebbe contribuire al normale sviluppo e alla patogenesi della malattia14,15. Questa tecnica è stata utilizzata con successo per dimostrare l’importanza di più geni e percorsi per la tumorigenesi NB6,16,17,18,19,20. Questo articolo introdurrà come è stata creata la linea transgenica del pesce che sovraesprime sia MYCN che LMO1 nel PSNS e come è stato dimostrato che la cooperazione di questi due oncogeni accelera l’insorgenza della tumorigenesi NB e delle metastasi13. In primo luogo, la linea transgenica che sovraesprime EGFP-MYCN sotto controllo del promotore dβh (linea MYCN designata) è stata sviluppata iniettando il costrutto dβh-EGFP-MYCN in uno stadio unicellulare di embrioni AB wild-type (WT), come precedentemente descritto6,17. Una linea transgenica separata che sovraesprime LMO1 nel PSNS (linea LMO1 designata) è stata sviluppata coniettando due costrutti di DNA, dβh-LMO1 e dβh-mCherry, in embrioni WT allo stadio di una cellula13. È stato precedentemente dimostrato che i costrutti a doppio DNA coiniettati possono essere cointerificati nel genoma del pesce; pertanto, LMO1 e mCherry sono coespressi nelle cellule PSNS degli animali transgenici. Una volta che gli embrioni F0 iniettati hanno raggiunto la maturità sessuale, sono stati poi superati con pesci WT per l’identificazione di pesci positivi con integrazione transgenica( s). In breve, la prole F1 è stata sottoposta per la prima volta a screening al microscopio fluorescente per l’espressione di mCherry nelle cellule PSNS. L’integrazione germinale di LMO1 nei pesci mCherry-positivi è stata ulteriormente confermata dalla PCR genomica e dal sequenziamento. Dopo aver identificato con successo ciascuna linea transgenica, la progenie di pesci transgenici eterozigoti MYCN e LMO1 è stata incrociata per generare una linea di pesce composta che esprime sia MYCN che LMO1 (designata MYCN; Linea LMO1). MYCN portante tumorale; I pesci LMO1 sono stati monitorati al microscopio fluorescente due volte alla settimana per l’evidenza di tumori metastatici nelle regioni distanti dal sito primario, regione della ghiandola interrenale (IRG, zebrafish equivalente della ghiandola surrenale umana)13. Confermare le metastasi dei tumori in MYCN; Sono state applicate analisi LMO1 per pesci, istologiche e immunoistochimiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il pesce zebra è stato comunemente utilizzato nella ricerca negli ultimi decenni, in particolare nella ricerca sul cancro, per ovvi motivi, come la sua facilità di manutenzione, la riproduzione robusta e chiari vantaggi per l’imaging in vivo1,28. Il modello del pesce zebra può essere facilmente manipolato embrionalmente a causa della loro fecondazione e sviluppo esterni, che si integra bene con gli organismi modello dei mammiferi, come ratti e topi, p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione R01 CA240323 (S.Z.) del National Cancer Institute; una sovvenzione W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) dal Dipartimento della Difesa degli Stati Uniti (DoD); un V Scholar award dalla V Foundation for Cancer Research (S.Z.) e un Platform Grant dal Mayo Center for Biomedical Discovery (S.Z.); e i supporti del Mayo Clinic Cancer Center e del Center for Individualized Medicine (S.Z.).
Materials
| 3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit | Vector | SK-4100 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific / Acros Organic | 64-19-7 | |
| Agarose GP2 | Midwest Scientific | 009012-36-6 | |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Pel-Freez | P40101 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| BOND Intense R Detection | Leica Biosystems | DS9263 | |
| BOND primary antibody diluent | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | AR9352 | |
| BOND-MAX IHC instrument | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | N/A | fully automated IHC staining system |
| CH211-270H11 BAC clone | BACPAC resources center (BRFC) | N/A | |
| Compound microscope equipped with DP71 camera | Olympus | AX70 | |
| Cytoseal XYL (xylene based mounting medium) | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Eosin | Leica | 3801601 | ready-to-use (no preparation needed) |
| Ethanol | Carolina | 86-1263 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
| Gateway BP Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-100 | |
| Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated) | Dako | E0432 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | HHS-32-1L | |
| HRP Avidin D | Vector | A-2004 | |
| Hydrochloric Acid | Aqua Solutions | 4360-1L | |
| Hydrogen Peroxide, 3% | Fisher Scientific | H324-500 | |
| I-SceI enzyme | New England Biolabs, MA | R0694L | |
| Kanamycin sulfate | Teknova, Inc. | K2150 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 34133 | |
| Lithium Carbonate | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
| Microtome for sectioning | Leica Biosystems | RM2255 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| p3E-polyA | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.) |
| Parafin wax | Surgipath Paraplast | 39603002 | Parrafin to parafin |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 | |
| pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites) | Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany | N/A | a generous gift |
| pDONR 221 gateway donor vector | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
| pDONRP4-P1R donor vector | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift |
| Phenol red, 0.5% | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X | BioRad | 1610780 | |
| Picrosirrius red stain kit | Polysciences | 24901-250 | |
| pME-mCherry | Addgene | 26028 | (DBH construct) |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Roche | 21712520 | |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| RDO Rapid Decalcifier | Apex Enginerring | RDO04 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
| Stereo fluorescence microscope | Leica | MZ10F | |
| Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging | Nikon | SMZ-1500 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs, MA | M0273L | |
| Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor | Sakura | N/A | Model #: VIP-6-A1 |
| Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
| Xylene | Thermo Fisher Scientific | X3P1GAL |
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