Modèle de poisson-zèbre de métastases de neuroblastome
Summary
Cet article présente la méthode de développement, de caractérisation et de suivi en temps réel des métastases tumorales dans le modèle de poisson zèbre du neuroblastome, en particulier dans la ligne transgénique de poisson-zèbre avec surexpression de MYCN et LMO1, qui développe des métastases spontanément.
Abstract
Le poisson-zèbre est devenu un modèle animal important pour étudier les maladies humaines, en particulier le cancer. Outre les technologies robustes d’édition transgénique et du génome appliquées à la modélisation du poisson-zèbre, la facilité d’entretien, la productivité à haut rendement et la puissante imagerie vivante font du poisson-zèbre un système modèle précieux pour étudier les métastases et les bases cellulaires et moléculaires sous-jacentes à ce processus in vivo. Le premier modèle de métastases du neuroblastome du poisson-zèbre (NB) a été développé en surexprimant deux oncogènes, MYCN et LMO1, sous contrôle du promoteur dopamine-bêta-hydroxylase (dβh). MyCN et LMO1 co-surexprimés ont conduit à la réduction de la latence et à l’augmentation de la pénétrance de la neuroblastomagenèse, ainsi qu’à une métastase à distance accélérée des cellules tumorales. Ce nouveau modèle réitère de manière fiable de nombreuses caractéristiques clés du NB métastatique humain, y compris l’implication d’altérations génétiques cliniquement pertinentes et associées aux métastases; développement naturel et spontané de métastases in vivo; et les sites conservés de métastases. Par conséquent, le modèle du poisson-zèbre possède des avantages uniques pour disséquer le processus complexe de métastases tumorales in vivo.
Introduction
Le poisson-zèbre a été largement utilisé et appliqué à plusieurs domaines de recherche, en particulier dans le cancer. Ce modèle offre de nombreux avantages, tels que sa reproduction robuste, son entretien rentable et sa visualisation polyvalente de la croissance tumorale et des métastases, qui font du poisson-zèbre un outil puissant pour étudier et étudier les bases cellulaires et moléculaires de la tumorigenèse et des métastases. De nouvelles techniques de cartographie du génome à grande échelle, de transgénèse, de surexpression ou d’assommation des gènes, de transplantation cellulaire et de criblages chimiques ont considérablement augmenté la puissance du modèle du poisson-zèbre1. Au cours des dernières années, de nombreuses lignées de poissons-zèbres ont été développées pour étudier la tumorigenèse et les métastases d’une variété de cancers humains, y compris, mais sans s’y limiter, la leucémie, le mélanome, le rhabdomyosarcome et le carcinome hépatocellulaire2,3,4,5. De plus, le premier modèle de poisson-zèbre de neuroblastome (NB) a été généré en surexprimant MYCN, un oncogène, dans le système nerveux sympathique périphérique (PSNS) sous le contrôle du promoteur de la dopamine-bêta-hydroxylase (dβh). Avec ce modèle, il a été démontré que l’ALK activé peut créer une synergie avec MYCN pour accélérer l’apparition de la tumeur et augmenter la pénétrance tumorale in vivo6.
NB est dérivé de la lignée sympatho-surrénale des cellules de la crête neurale et est un cancer hautement métastatique chez les enfants7. Il est responsable de 10 % des décès liés au cancer pédiatrique8. Largement métastasé au moment du diagnostic, nb peut être cliniquement présenté comme des tumeurs provenant principalement le long de la chaîne des ganglions sympathiques et de la médullosurrénale de PSNS9,10. L’amplification du MYCN est généralement associée à de mauvais résultats chez les patients atteints de NB11,12. De plus, l’OVM1 a été identifié comme un gène critique de susceptibilité au NB dans les cas à haut risque13,14. Des études ont montré que la coexpression transgénique de MYCN et de LMO1 dans le PSNS du modèle du poisson-zèbre favorise non seulement l’apparition précoce du NB, mais induit également des métastases généralisées dans les tissus et les organes qui sont similaires aux sites couramment observés chez les patients atteints de NB13 à haut risque. Très récemment, un autre phénotype métastatique de NB a également été observé dans un nouveau modèle de POISSON-zèbre de NB, dans lequel MYCN et Lin28B, codant pour une protéine de liaison à l’ARN, sont surexprimés sous le contrôle du promoteur dβh16.
L’approche transgénique stable chez le poisson-zèbre est souvent utilisée pour étudier si la surexpression d’un gène d’intérêt pourrait contribuer au développement normal et à la pathogenèse de la maladie14,15. Cette technique a été utilisée avec succès pour démontrer l’importance de plusieurs gènes et voies pour la tumorigenèse NB6,16,17,18,19,20. Cet article présentera comment la lignée de poissons transgénique qui surexprime à la fois MYCN et LMO1 dans le PSNS a été créée et comment il a été démontré que la coopération de ces deux oncogènes accélère l’apparition de la tumorigenèse NB et des métastases13. Tout d’abord, la lignée transgénique qui surexprime EGFP-MYCN sous le contrôle du promoteur dβh (lignée MYCN désignée) a été développée en injectant la construction dβh-EGFP-MYCN dans une étape unicellulaire d’embryons AB de type sauvage (WT), comme décrit précédemment6,17. Une lignée transgénique distincte qui surexprime LMO1 dans la PSNS (lignée désignée LMO1) a été développée en cojectant deux constructions d’ADN, dβh-LMO1 et dβh-mCherry, dans des embryons WT au stade unicellulaire13. Il a déjà été démontré que les constructions à double ADN co-projetées peuvent être cointégrées dans le génome du poisson; par conséquent, LMO1 et mCherry sont coexprimés dans les cellules PSNS des animaux transgéniques. Une fois que les embryons F0 injectés ont atteint la maturité sexuelle, ils ont ensuite été croisés avec des poissons WT pour l’identification de poissons positifs avec intégration transgénique(s). En bref, la progéniture F1 a d’abord été examinée par microscopie fluorescente pour l’expression de mCherry dans les cellules PSNS. L’intégration germinale du LMO1 chez les poissons mCherry-positifs a été confirmée par PCR génomique et séquençage. Après identification réussie de chaque lignée transgénique, la descendance de poissons transgéniques hétérozygotes MYCN et LMO1 a été croisée pour générer une lignée de poissons composée exprimant à la fois MYCN et LMO1 (désigné MYCN; Ligne LMO1). MYCN porteur de tumeur; Les poissons LMO1 ont été surveillés par microscopie fluorescente toutes les deux semaines pour détecter la présence de tumeurs métastatiques dans les régions éloignées du site primaire, région de la glande interrénale (IRG, équivalent poisson-zèbre de la glande surrénale humaine)13. Confirmer la métastase des tumeurs dans MYCN; Des analyses LMO1, histologiques et immunohistochimiques ont été appliquées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le poisson-zèbre est couramment utilisé dans la recherche depuis quelques décennies, en particulier dans la recherche sur le cancer, pour des raisons évidentes, telles que sa facilité d’entretien, sa reproduction robuste et ses avantages évidents pour l’imagerie in vivo1,28. Le modèle du poisson-zèbre peut être facilement manipulé embryonnairement en raison de sa fécondation externe et de son développement, ce qui complète bien les organ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention R01 CA240323 (S.Z.) de l’Institut national du cancer; une subvention W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) du Département de la Défense des États-Unis (DoD); un prix V Scholar de la V Foundation for Cancer Research (S.Z.) et une subvention de plateforme du Mayo Center for Biomedical Discovery (S.Z.); et le soutien du Mayo Clinic Cancer Center et du Center for Individualized Medicine (S.Z.).
Materials
| 3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit | Vector | SK-4100 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific / Acros Organic | 64-19-7 | |
| Agarose GP2 | Midwest Scientific | 009012-36-6 | |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Pel-Freez | P40101 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| BOND Intense R Detection | Leica Biosystems | DS9263 | |
| BOND primary antibody diluent | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | AR9352 | |
| BOND-MAX IHC instrument | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | N/A | fully automated IHC staining system |
| CH211-270H11 BAC clone | BACPAC resources center (BRFC) | N/A | |
| Compound microscope equipped with DP71 camera | Olympus | AX70 | |
| Cytoseal XYL (xylene based mounting medium) | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Eosin | Leica | 3801601 | ready-to-use (no preparation needed) |
| Ethanol | Carolina | 86-1263 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
| Gateway BP Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-100 | |
| Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated) | Dako | E0432 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | HHS-32-1L | |
| HRP Avidin D | Vector | A-2004 | |
| Hydrochloric Acid | Aqua Solutions | 4360-1L | |
| Hydrogen Peroxide, 3% | Fisher Scientific | H324-500 | |
| I-SceI enzyme | New England Biolabs, MA | R0694L | |
| Kanamycin sulfate | Teknova, Inc. | K2150 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 34133 | |
| Lithium Carbonate | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
| Microtome for sectioning | Leica Biosystems | RM2255 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| p3E-polyA | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.) |
| Parafin wax | Surgipath Paraplast | 39603002 | Parrafin to parafin |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 | |
| pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites) | Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany | N/A | a generous gift |
| pDONR 221 gateway donor vector | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
| pDONRP4-P1R donor vector | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift |
| Phenol red, 0.5% | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X | BioRad | 1610780 | |
| Picrosirrius red stain kit | Polysciences | 24901-250 | |
| pME-mCherry | Addgene | 26028 | (DBH construct) |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Roche | 21712520 | |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| RDO Rapid Decalcifier | Apex Enginerring | RDO04 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
| Stereo fluorescence microscope | Leica | MZ10F | |
| Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging | Nikon | SMZ-1500 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs, MA | M0273L | |
| Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor | Sakura | N/A | Model #: VIP-6-A1 |
| Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
| Xylene | Thermo Fisher Scientific | X3P1GAL |
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