מודל דגי זברה של גרורות נוירובלסטומה
Summary
מאמר זה מציג את השיטה של פיתוח, אפיון ומעקב בזמן אמת של גרורות הגידול במודל דגי הזברה של נוירובלסטומה, במיוחד בקו דגי הזברה הטרנסגניים עם ביטוי יתר של MYCN ו- LMO1, המפתח גרורות באופן ספונטני.
Abstract
דגי זברה התפתחו כמודל חשוב לבעלי חיים לחקר מחלות אנושיות, במיוחד סרטן. יחד עם טכנולוגיות עריכת הטרנסגניות והגנום החזקות המיושמות במודלים של דגי זברה, קלות התחזוקה, הפרודוקטיביות בתפוקה גבוהה והדמיה חיה רבת עוצמה הופכים את דג הזברה למערכת מודל בעלת ערך לחקר גרורות ובסיסים תאיים ומולקולריים העומדים בבסיס תהליך זה ב- vivo. הדגם הראשון של דגי זברה נוירובלסטומה (NB) של גרורות פותח על ידי ביטוי יתר של שני אונקוגנים, MYCN ו – LMO1, תחת שליטה של מקדם הדופמין-בטא-הידרוקסילאז (dβh). MYCN ו- LMO1 המחושבים יתר על המידה הובילו להשהיה מופחתת ולחדירה מוגברת של נוירובלסטומגנסיס, כמו גם גרורות רחוקות מואצות של תאים סרטניים. מודל חדש זה חוזר על תכונות מרכזיות רבות של NB גרורתי אנושי, כולל מעורבות של שינויים גנטיים רלוונטיים מבחינה קלינית וגרורות; התפתחות טבעית וספונטנית של גרורות ב vivo; ואתרים שמורים של גרורות. לכן, למודל דגי הזברה יש יתרונות ייחודיים לנתח את התהליך המורכב של גרורות הגידול ב- vivo.
Introduction
דגי זברה כבר בשימוש נרחב ויושם על מספר תחומי מחקר, במיוחד בסרטן. מודל זה מספק יתרונות רבים – כגון הרבייה החזקה שלו, תחזוקה חסכונית, והדמיה רב-תכליתית של גידול גידול וגרורות – כל אלה הופכים את דגי הזברה לכלי רב עוצמה לחקור ולחקור את הבסיסים התאיים והמולקולריים של גידולים וגרורות. טכניקות חדשות למיפוי גנום בקנה מידה גדול, טרנסגנזה, ביטוי יתר של גנים או נוקאאוט, השתלת תאים ומסכים כימיים הגדילו מאוד את כוחו של דג הזברה מודל1. במהלך השנים האחרונות, קווי דגי זברה רבים פותחו כדי לחקור גידולים וגרורות של מגוון סוגי סרטן אנושיים, כולל אך לא מוגבל ללוקמיה, מלנומה, rhabdomyosarcoma, קרצינומה hepatocellular2,3,4,5. בנוסף, מודל דג הזברה הראשון של נוירובלסטומה (NB) נוצר על ידי ביטוי יתר MYCN, אונקוגן, במערכת העצבים הסימפתטית ההיקפית (PSNS) תחת שליטה של מקדם דופמין-בטא-הידרוקסילאז (dβh). עם מודל זה, הוכח עוד כי ALK מופעל יכול להתמזג עם MYCN כדי להאיץ את הופעת הגידול ולהגדיל את החדירות הגידול ב vivo6.
NB נגזר מן השושלת הסימפתודואדרנלית של תאי הסמל העצבי, והוא סרטן גרורתי מאוד אצל ילדים7. הוא אחראי ל -10% ממקרי המוות הקשורים לסרטן ילדים8. גרורות נרחבות באבחון, NB יכול להיות מוצג קלינית כגידולים שמקורם בעיקר לאורך השרשרת של הגרעינים האוהדים ואת המדולה יותרת הכליה של PSNS9,10. הגברה MYCN קשורה בדרך כלל עם תוצאות גרועות בחולי NB11,12. יתר על כן, LMO1 זוהה כגן רגישות NB קריטי במקרים בסיכון גבוה13,14. מחקרים מצאו כי דו-אופן הפעולה מהונדס של MYCN ו– LMO1 ב- PSNS של מודל דגי הזברה לא רק מקדם התחלה מוקדמת יותר של NB, אלא גם גורם גרורות נרחבות לרקמות ולאיברים הדומים לאתרים הנפוצים בחולים עם NB13 בסיכון גבוה. לאחרונה, פנוטיפ גרורתי נוסף של NB נצפתה גם במודל חדש יותר של דגי זברה של NB, שבו הן MYCN ו– Lin28B, קידוד חלבון מחייב RNA, מתבטאים יתר על המידה תחת שליטה של מקדם dβh16.
הגישה הטרנסגנית היציבה בדגי זברה משמשת לעתים קרובות כדי לחקור אם ביטוי יתר של גן עניין יכול לתרום להתפתחות נורמלית ומחלות pathogenesis14,15. טכניקה זו שימשה בהצלחה כדי להדגים את החשיבות של גנים מרובים ומסלולים לגידול NB6,16,17,18,19,20. מאמר זה יציג כיצד קו הדגים הטרנסגני שמבטא יתר על המידה הן את MYCN והן את LMO1 ב- PSNS נוצר וכיצד הוכח כי שיתוף הפעולה של שני האונקוגנים האלה מאיץ את הופעת הגידול של NB וגרורות13. ראשית, הקו הטרנסגני המבטא יתר על המידה EGFP-MYCN תחת שליטה של מקדם dβh (קו MYCN ייעודי) פותח על ידי הזרקת dβh-EGFP-MYCN לבנות לשלב תא אחד של עוברי AB מסוג בר (WT), כפי שתואר בעבר 6,17. קו מהונדסי נפרד המבטא יתר על המידה את LMO1 ב- PSNS (קו LMO1 ייעודי) פותח על ידי חפיפה בין שני מבני DNA, dβh-LMO1 ו– dβh-mCherry, לעוברי WT בשלב תא אחד13. בעבר הוכח כי ניתן לחפוף למבני דנ”א כפולים חופפים לגנום הדגים; לכן, LMO1 ו mCherry הם coexpressed בתאי PSNS של בעלי חיים מהונדסים. ברגע שהעוברים המוזרקים F0 הגיעו לבגרות מינית, הם אז היו מחוץ לחצות עם דגי WT לזיהוי של דגים חיוביים עם שילוב של טרנסג’נים. בקצרה, צאצאי F1 נבדקו לראשונה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית לביטוי mCherry בתאי PSNS. שילוב נבטים של LMO1 בדגים mCherry-חיובי אושרה עוד יותר על ידי PCR גנומי ורצף. לאחר זיהוי מוצלח של כל קו מהונדס, הצאצאים של דג הטרוזיגוס MYCN ו– LMO1 מהונדסים היו שזורים כדי ליצור קו דגים מורכב המבטא הן את MYCN והן את LMO1 (המכונה MYCN; קו LMO1). MYCN נושא גידול; דגי LMO1 היו במעקב על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית דו-שבועית לראיות לגידולים גרורתיים באזורים המרוחקים לאתר הראשי, אזור בלוטת יותרת הכליה הבין-יותרת הכליה (IRG, שווה ערך לדגי זברה של בלוטת יותרת הכליה האנושית)13. כדי לאשר את גרורות של גידולים MYCN; דגי LMO1, ניתוחים היסטולוגיים ואימונוהיסטוכימיים יושמו.
Protocol
Representative Results
Discussion
דגי זברה משמשים בדרך כלל במחקר בעשורים האחרונים, במיוחד בחקר הסרטן, מסיבות ברורות, כגון קלות התחזוקה שלו, רבייה חזקה, ויתרונות ברורים להדמיית vivo1,28. מודל דגי הזברה יכול להיות מניפולציה בקלות עוברית בשל ההפריה החיצונית שלהם והתפתחות, אשר משלים היטב אורגנ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק R01 CA240323 (S.Z. ) מהמכון הלאומי לסרטן; מענק W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) ממשרד ההגנה של ארצות הברית (DoD); פרס V Scholar מטעם קרן V לחקר הסרטן (S.Z.) ומענק פלטפורמה ממרכז מאיו לגילוי ביו-רפואי (S.Z.); ותומכים ממרכז מאיו קליניק לסרטן והמרכז לרפואה אישית (ש.ז.).
Materials
| 3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit | Vector | SK-4100 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific / Acros Organic | 64-19-7 | |
| Agarose GP2 | Midwest Scientific | 009012-36-6 | |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Pel-Freez | P40101 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| BOND Intense R Detection | Leica Biosystems | DS9263 | |
| BOND primary antibody diluent | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | AR9352 | |
| BOND-MAX IHC instrument | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | N/A | fully automated IHC staining system |
| CH211-270H11 BAC clone | BACPAC resources center (BRFC) | N/A | |
| Compound microscope equipped with DP71 camera | Olympus | AX70 | |
| Cytoseal XYL (xylene based mounting medium) | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Eosin | Leica | 3801601 | ready-to-use (no preparation needed) |
| Ethanol | Carolina | 86-1263 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
| Gateway BP Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-100 | |
| Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated) | Dako | E0432 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | HHS-32-1L | |
| HRP Avidin D | Vector | A-2004 | |
| Hydrochloric Acid | Aqua Solutions | 4360-1L | |
| Hydrogen Peroxide, 3% | Fisher Scientific | H324-500 | |
| I-SceI enzyme | New England Biolabs, MA | R0694L | |
| Kanamycin sulfate | Teknova, Inc. | K2150 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 34133 | |
| Lithium Carbonate | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
| Microtome for sectioning | Leica Biosystems | RM2255 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| p3E-polyA | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.) |
| Parafin wax | Surgipath Paraplast | 39603002 | Parrafin to parafin |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 | |
| pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites) | Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany | N/A | a generous gift |
| pDONR 221 gateway donor vector | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
| pDONRP4-P1R donor vector | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift |
| Phenol red, 0.5% | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X | BioRad | 1610780 | |
| Picrosirrius red stain kit | Polysciences | 24901-250 | |
| pME-mCherry | Addgene | 26028 | (DBH construct) |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Roche | 21712520 | |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| RDO Rapid Decalcifier | Apex Enginerring | RDO04 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
| Stereo fluorescence microscope | Leica | MZ10F | |
| Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging | Nikon | SMZ-1500 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs, MA | M0273L | |
| Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor | Sakura | N/A | Model #: VIP-6-A1 |
| Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
| Xylene | Thermo Fisher Scientific | X3P1GAL |
References
- Veldman, M., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Research. 6 (5), 694 (2008).
- Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2010).
- Benjamin, D. C., Hynes, R. O. Intravital imaging of metastasis in adult Zebrafish. BMC Cancer. 17 (1), 660 (2017).
- Kim, I. S., et al. Microenvironment-derived factors driving metastatic plasticity in melanoma. Nature Communications. 8, 14343 (2017).
- Zhu, S., et al. Activated ALK collaborates with MYCN in neuroblastoma pathogenesis. Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).
- Maris, J. M., Hogarty, M. D., Bagatell, R., Cohn, S. L. Neuroblastoma. Lancet. 369 (9579), 2106-2120 (2007).
- Park, J. R., et al. Children’s oncology group’s 2013 blueprint for research: neuroblastoma. Pediatric Blood and Cancer. 60 (6), 985-993 (2013).
- Hoehner, J. C., et al. A developmental model of neuroblastoma: differentiating stroma-poor tumors’ progress along an extra-adrenal chromaffin lineage. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 75 (5), 659-675 (1996).
- Tsubota, S., Kadomatsu, K. Origin and initiation mechanisms of neuroblastoma. Cell and Tissue Research. 372 (2), 211-221 (2018).
- Tolbert, V. P., Matthay, K. K. Neuroblastoma: Clinical and biological approach to risk stratification and treatment. Cell and Tissue Research. 372 (2), 195-209 (2018).
- Maris, J. M. Recent advances in neuroblastoma. New England Journal of Medicine. 362 (23), 2202-2211 (2010).
- Zhu, S., et al. LMO1 Synergizes with MYCN to promote neuroblastoma initiation and metastasis. Cancer Cell. 32, 310-323 (2017).
- Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Tao, T., et al. LIN28B regulates transcription and potentiates MYCN-induced neuroblastoma through binding to ZNF143 at target gene promotors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (28), 16516-16526 (2020).
- Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (97), e52567 (2015).
- Zhang, X., et al. Critical role for GAB2 in neuroblastoma pathogenesis through the promotion of SHP2/MYCN cooperation. Cell Reports. 18 (12), 2932-2942 (2017).
- Zimmerman, M. W., et al. MYC drives a subset of high-risk pediatric neuroblastomas and is activated through mechanisms including enhancer hijacking and focal enhancer amplification. Cancer Discovery. 8 (3), 320-335 (2018).
- Koach, J., et al. Drugging MYCN oncogenic signaling through the MYCN-PA2G4 binding interface. 암 연구학. 79 (21), 5652-5667 (2019).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- DuBois, S. G., et al. Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival. Journal of pediatric hematology/oncology. 21 (3), 181-189 (1999).
- Wattrus, S. J., Zon, L. I. Stem cell safe harbor: The hematopoietic stem cell niche in zebrafish. Blood Advances. 2 (21), 3063-3069 (2018).
- Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicologic Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: Zebrafish and vertebrate immunity. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
- Junqueira, L. C., Cossermelli, W., Brentani, R. Differential staining of collagens type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy. Archivum histologicum Japonicum (Nihon Soshikigaku Kiroku). 41 (3), 267-274 (1978).
- Sweat, F., Puchtler, H., Rosenthal, S. I. Sirius red F3BA as a stain for connective tissue. Archives of Pathology. 78, 69-72 (1964).
- Ignatius, M. S., Hayes, M., Langenau, D. M. In vivo imaging of cancer in zebrafish. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 219-237 (2016).
- Howe, C. K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 20 (5), 263-273 (2020).
- Yoganantharjah, P., Gibert, Y. The Use of the zebrafish model to aid in drug discovery and target validation. Current Topics in Medicinal Chemistry. 17 (18), 2041-2055 (2018).
- Ignatius, M. S., et al. In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 21 (5), 680-693 (2012).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Ahmed, S., et al. Neuroblastoma with orbital metastasis: ophthalmic presentation and role of ophthalmologists. Eye. 20 (4), 466-470 (2006).
- Papaioannou, G., McHugh, K. Neuroblastoma in childhood: review and radiological findings. Cancer Imaging Society. 5 (1), 116-127 (2005).
- Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
- Amores, A., et al. Zebrafish hox clusters and vertebrate genome evolution. Science. 282 (5394), 1711-1714 (1998).
- Postlethwait, J. H., et al. Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map. Nature Genetics. 18 (4), 345-349 (1998).
- Opazo, J. C., et al. Whole-genome duplication and the functional diversification of teleost fish hemoglobins. Molecular Biology and Evolution. 30 (1), 140-153 (2013).
