ज़ेब्राफ़िश न्यूरोब्लास्टोमा मेटास्टेसिस का मॉडल
Summary
यह पेपर न्यूरोब्लास्टोमा के ज़ेब्राफ़िश मॉडल में ट्यूमर मेटास्टेसिस को वास्तविक समय में विकसित करने, विशेषता और ट्रैक करने की विधि का परिचय देता है, विशेष रूप से MYCN और LMO1 के ओवरएक्सप्रेशन के साथ ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफ़िश लाइन में, जो अनायास मेटास्टेसिस विकसित करता है।
Abstract
ज़ेबराफ़िश मानव रोगों, विशेष रूप से कैंसर का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण पशु मॉडल के रूप में उभरा है। ज़ेब्राफ़िश मॉडलिंग में लागू मजबूत ट्रांसजेनिक और जीनोम संपादन प्रौद्योगिकियों के साथ- साथ, रखरखाव में आसानी, उच्च उपज उत्पादकता, और शक्तिशाली लाइव इमेजिंग पूरी तरह से जेब्राफ़िश को मेटास्टेसिस और सेलुलर और आणविक आधारों का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल प्रणाली बनाती है जो विवो में इस प्रक्रिया को अंतर्निहित करती है। मेटास्टेसिस का पहला ज़ेब्राफ़िश न्यूरोब्लास्टोमा (एनबी) मॉडल डोपामाइन-बीटा-हाइड्रॉक्सिलेस (डीएच) प्रमोटर के नियंत्रण में दो ऑन्कोजीन, MYCN और LMO1 को अतिरंजित करके विकसित किया गया था। सह-overexpressed MYCN और LMO1 कम विलंबता और neuroblastomagenesis के penetrance में वृद्धि हुई, साथ ही साथ ट्यूमर कोशिकाओं के त्वरित दूर मेटास्टेसिस के लिए नेतृत्व किया। यह नया मॉडल मज़बूती से मानव मेटास्टैटिक एनबी की कई प्रमुख विशेषताओं को दोहराता है, जिसमें नैदानिक रूप से प्रासंगिक और मेटास्टेसिस से जुड़े आनुवंशिक परिवर्तनों की भागीदारी शामिल है; विवो में मेटास्टेसिस का प्राकृतिक और सहज विकास; और मेटास्टेसिस के संरक्षित स्थलों. इसलिए, जेब्राफ़िश मॉडल में विवो में ट्यूमर मेटास्टेसिस की जटिल प्रक्रिया को विच्छेदित करने के लिए अद्वितीय फायदे हैं।
Introduction
ज़ेबराफ़िश का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है और अनुसंधान के कई क्षेत्रों में लागू किया गया है, विशेष रूप से कैंसर में। यह मॉडल कई फायदे प्रदान करता है- जैसे कि इसके मजबूत प्रजनन, लागत प्रभावी रखरखाव, और ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस के बहुमुखी विज़ुअलाइज़ेशन- जिनमें से सभी ज़ेबराफ़िश को एक शक्तिशाली उपकरण बनाते हैं जो जेब्राफ़िश को सेलुलर और आणविक आधारों का अध्ययन करने और जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनाते हैं। बड़े पैमाने पर जीनोम मैपिंग, ट्रांसजेनेसिस, जीन ओवरएक्सप्रेशन या नॉकआउट, सेल प्रत्यारोपण और रासायनिक स्क्रीन के लिए नई तकनीकों ने ज़ेबराफ़िश मॉडल 1 की शक्ति को बेहद बढ़ाया है। पिछले कुछ वर्षों के दौरान, कई ज़ेबराफ़िश लाइनों को विभिन्न प्रकार के मानव कैंसर के मेटास्टेसिस और मेटास्टेसिस का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है, जिसमें ल्यूकेमिया, मेलेनोमा, रैबडोमायोसारकोमा और हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा 2,3,4,5 शामिल हैं, लेकिन सीमित नहीं हैं। इसके अतिरिक्त, न्यूरोब्लास्टोमा (एनबी) का पहला ज़ेब्राफ़िश मॉडल डोपामाइन-बीटा-हाइड्रॉक्सिलेस (डीएच) प्रमोटर के नियंत्रण में परिधीय सहानुभूति तंत्रिका तंत्र (पीएसएनएस) में एमवाईसीएन, एक ऑन्कोजीन को अतिरंजित करके उत्पन्न किया गया था। इस मॉडल के साथ, यह आगे प्रदर्शित किया गया था कि सक्रिय एएलके ट्यूमर की शुरुआत में तेजी लाने और विवो 6 में ट्यूमर पेनिट्रेंस को बढ़ाने के लिए MYCN के साथ तालमेल कर सकता है।
एनबी तंत्रिका शिखा कोशिकाओं के sympathoadrenal वंश से व्युत्पन्न है, और बच्चों में एक अत्यधिक मेटास्टैटिक कैंसर है7. यह बाल चिकित्सा कैंसर से संबंधित मौतों के 10% के लिए जिम्मेदार है8। निदान पर व्यापक रूप से metastasized, एनबी को नैदानिक रूप से ट्यूमर के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है जो मुख्य रूप से सहानुभूति गैन्ग्लिया की श्रृंखला और PSNS9,10 के अधिवृक्क मज्जा के साथ उत्पन्न होता है। MYCN प्रवर्धन आमतौर पर NB रोगियों 11,12 में खराब परिणामों के साथ जुड़ा हुआ है। इसके अलावा, LMO1 को उच्च जोखिम वाले मामलों में एक महत्वपूर्ण एनबी संवेदनशीलता जीन के रूप में पहचाना गया है13,14। अध्ययनों में पाया गया कि ज़ेब्राफ़िश मॉडल के पीएसएनएस में MYCN और LMO1 का ट्रांसजेनिक coexpression न केवल NB की पहले की शुरुआत को बढ़ावा देता है, बल्कि ऊतकों और अंगों के लिए व्यापक मेटास्टेसिस को भी प्रेरित करता है जो आमतौर पर उच्च जोखिम वाले NB13 वाले रोगियों में देखी जाने वाली साइटों के समान होते हैं। हाल ही में, एनबी के एक और मेटास्टैटिक फेनोटाइप को एनबी के एक नए ज़ेब्राफ़िश मॉडल में भी देखा गया है, जिसमें MYCN और Lin28B दोनों, एक आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन को एन्कोडिंग करते हैं, को डीएच प्रमोटर 16 के नियंत्रण में अतिरंजित किया जाता है।
ज़ेब्राफ़िश में स्थिर ट्रांसजेनिक दृष्टिकोण का उपयोग अक्सर यह अध्ययन करने के लिए किया जाता है कि क्या ब्याज के जीन का ओवरएक्सप्रेशन सामान्य विकास और रोग रोगजनन में योगदान कर सकता है14,15। इस तकनीक का सफलतापूर्वक उपयोग कई जीनों और मार्गों के महत्व को प्रदर्शित करने के लिए किया गया है, जो एनबी के लिए 6,16,17,18,19,20 है। यह पेपर पेश करेगा कि कैसे ट्रांसजेनिक मछली लाइन जो पीएसएनएस में MYCN और LMO1 दोनों को अतिरंजित करती है, बनाई गई थी और यह कैसे प्रदर्शित किया गया था कि इन दो ऑन्कोजीन के सहयोग से एनबी और मेटास्टेसिस 13 की शुरुआत में तेजी आती है। सबसे पहले, ट्रांसजेनिक लाइन जो EGFP-MYCN को अतिरंजित करती है, जो dπh प्रमोटर (नामित MYCN लाइन) के नियंत्रण में है, को जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) एबी भ्रूण के एक-सेल चरण में dπh-EGFP-MYCN निर्माण को इंजेक्ट करके विकसित किया गया था, जैसा कि पहले वर्णित 6,17 था। एक अलग ट्रांसजेनिक लाइन जो PSNS (नामित LMO1 लाइन) में LMO1 को overexpresses करती है, को दो डीएनए निर्माणों, dπh-LMO1 और dπh-mCherry को एक-सेल चरण 13 पर डब्ल्यूटी भ्रूण में सह-इंजेक्शन द्वारा विकसित किया गया था। यह पहले प्रदर्शित किया गया है कि coinjected डबल डीएनए निर्माणों मछली जीनोम में cointegrated किया जा सकता है; इसलिए, LMO1 और mCherry ट्रांसजेनिक जानवरों के PSNS कोशिकाओं में coexpressed हैं। एक बार इंजेक्ट किए गए एफ 0 भ्रूण यौन परिपक्वता तक पहुंचने के बाद, उन्हें ट्रांसजीन (एस) एकीकरण के साथ सकारात्मक मछली की पहचान के लिए डब्ल्यूटी मछली के साथ आउट-क्रॉस किया गया था। संक्षेप में, F1 संतानों को पहली बार PSNS कोशिकाओं में mCherry अभिव्यक्ति के लिए फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा जांचा गया था। mCherry-positive fish में LMO1 के germline integration को जीनोमिक PCR और sequencing द्वारा आगे की पुष्टि की गई थी। प्रत्येक ट्रांसजेनिक लाइन की सफल पहचान के बाद, विषमयुग्मजी MYCN और LMO1 ट्रांसजेनिक मछली की संतानों को MYCN और LMO1 (नामित MYCN) दोनों को व्यक्त करने वाली एक यौगिक मछली लाइन उत्पन्न करने के लिए इंटरब्रीड किया गया था; एलएमओ 1 लाइन)। ट्यूमर असर MYCN; LMO1 मछली को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्विसाप्ताहिक रूप से प्राथमिक साइट, इंटररेनल ग्रंथि क्षेत्र (IRG, मानव अधिवृक्क ग्रंथि के बराबर ज़ेब्राफ़िश) से दूर के क्षेत्रों में मेटास्टैटिक ट्यूमर के सबूत के लिए निगरानी की गई थी। MYCN में ट्यूमर के मेटास्टेसिस की पुष्टि करने के लिए; LMO1 मछली, हिस्टोलॉजिकल और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण लागू किए गए थे।
Protocol
Representative Results
Discussion
ज़ेबराफ़िश का उपयोग आमतौर पर पिछले कुछ दशकों से अनुसंधान में किया जाता है, विशेष रूप से कैंसर अनुसंधान में, स्पष्ट कारणों से, जैसे कि रखरखाव में आसानी, मजबूत प्रजनन, और विवो इमेजिंग 1,28 के …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय कैंसर संस्थान से एक अनुदान R01 CA240323 (S.Z.) द्वारा समर्थित किया गया था; संयुक्त राज्य अमेरिका के रक्षा विभाग (डीओडी) से एक अनुदान W81XWH-17-1-0498 (S.Z.); कैंसर अनुसंधान के लिए वी फाउंडेशन (एसजेड) से एक वी विद्वान पुरस्कार और बायोमेडिकल डिस्कवरी (एसजेड) के लिए मेयो सेंटर से एक मंच अनुदान; और मेयो क्लिनिक कैंसर सेंटर और सेंटर फॉर इंडिविजुअलाइज्ड मेडिसिन (एसजेड) से समर्थन करता है।
Materials
| 3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit | Vector | SK-4100 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific / Acros Organic | 64-19-7 | |
| Agarose GP2 | Midwest Scientific | 009012-36-6 | |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Pel-Freez | P40101 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| BOND Intense R Detection | Leica Biosystems | DS9263 | |
| BOND primary antibody diluent | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | AR9352 | |
| BOND-MAX IHC instrument | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | N/A | fully automated IHC staining system |
| CH211-270H11 BAC clone | BACPAC resources center (BRFC) | N/A | |
| Compound microscope equipped with DP71 camera | Olympus | AX70 | |
| Cytoseal XYL (xylene based mounting medium) | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Eosin | Leica | 3801601 | ready-to-use (no preparation needed) |
| Ethanol | Carolina | 86-1263 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
| Gateway BP Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-100 | |
| Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated) | Dako | E0432 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | HHS-32-1L | |
| HRP Avidin D | Vector | A-2004 | |
| Hydrochloric Acid | Aqua Solutions | 4360-1L | |
| Hydrogen Peroxide, 3% | Fisher Scientific | H324-500 | |
| I-SceI enzyme | New England Biolabs, MA | R0694L | |
| Kanamycin sulfate | Teknova, Inc. | K2150 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 34133 | |
| Lithium Carbonate | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
| Microtome for sectioning | Leica Biosystems | RM2255 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| p3E-polyA | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.) |
| Parafin wax | Surgipath Paraplast | 39603002 | Parrafin to parafin |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 | |
| pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites) | Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany | N/A | a generous gift |
| pDONR 221 gateway donor vector | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
| pDONRP4-P1R donor vector | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift |
| Phenol red, 0.5% | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X | BioRad | 1610780 | |
| Picrosirrius red stain kit | Polysciences | 24901-250 | |
| pME-mCherry | Addgene | 26028 | (DBH construct) |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Roche | 21712520 | |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| RDO Rapid Decalcifier | Apex Enginerring | RDO04 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
| Stereo fluorescence microscope | Leica | MZ10F | |
| Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging | Nikon | SMZ-1500 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs, MA | M0273L | |
| Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor | Sakura | N/A | Model #: VIP-6-A1 |
| Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
| Xylene | Thermo Fisher Scientific | X3P1GAL |
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