Модель метастазов нейробластомы рыбок данио
Summary
В данной работе представлен метод разработки, характеристики и отслеживания в режиме реального времени метастазирования опухоли в модели нейробластомы рыбок данио, в частности в трансгенной линии рыбок данио с гиперэкспрессией MYCN и LMO1, которая развивает метастазирование спонтанно.
Abstract
Рыбки данио стали важной животной моделью для изучения заболеваний человека, особенно рака. Наряду с надежными трансгенными технологиями и технологиями редактирования генома, применяемыми в моделировании рыбок данио, простота обслуживания, высокая продуктивность и мощная живая визуализация в целом делают рыбок данио ценной модельной системой для изучения метастазов и клеточных и молекулярных основ, лежащих в основе этого процесса in vivo. Первая модель метастазирования нейробластомы рыбок данио (NB) была разработана путем сверхэкспрессии двух онкогенов, MYCN и LMO1, под контролем промотора дофамина-бета-гидроксилазы (dβh). Ко-сверхэкспрессированные MYCN и LMO1 приводили к снижению латентности и усилению пенетрантности нейробластомагенеза, а также ускорению отдаленного метастазирования опухолевых клеток. Эта новая модель достоверно повторяет многие ключевые особенности метастатического НБ человека, включая участие клинически значимых и связанных с метастазами генетических изменений; естественное и спонтанное развитие метастазов in vivo; и сохраненные участки метастазов. Поэтому модель рыбок данио обладает уникальными преимуществами для рассечения сложного процесса метастазирования опухоли in vivo.
Introduction
Рыбки данио широко используются и применяются в нескольких областях исследований, особенно при раке. Эта модель предоставляет множество преимуществ, таких как ее надежное размножение, экономически эффективное поддержание и универсальная визуализация роста опухоли и метастазирования – все это делает рыбок данио мощным инструментом для изучения и исследования клеточных и молекулярных основ опухолевого генеза и метастазирования. Новые методы крупномасштабного картирования генома, трансгенеза, сверхэкспрессии или нокаута генов, трансплантации клеток и химических экранов значительно увеличили мощность модели рыбок данио1. За последние несколько лет было разработано много линий рыбок данио для изучения опухолевого генеза и метастазирования различных видов рака человека, включая, но не ограничиваясь, лейкемией, меланомой, рабдомиосаркомой и гепатоцеллюлярной карциномой2,3,4,5. Кроме того, первая модель нейробластомы рыбок данио (NB) была получена путем сверхэкспрессии MYCN, онкогена, в периферической симпатической нервной системе (PSNS) под контролем промотора дофамина-бета-гидроксилазы (dβh). С помощью этой модели было дополнительно продемонстрировано, что активированный ALK может синергировать с MYCN для ускорения начала опухоли и увеличения пенетрантности опухоли in vivo6.
NB получен из симпатоадреналовой линии клеток нервного гребня и является высокометастатическим раком у детей7. Он ответственен за 10% детских смертей, связанных с раком8. Широко метастазируемый при постановке диагноза, NB может быть клинически представлен как опухоли, в основном происходящие по цепочке симпатических ганглиев и мозгового вещества надпочечников PSNS9,10. Амплификация MYCN обычно связана с плохими исходами у пациентов с NB11,12. Кроме того, LMO1 был идентифицирован как критический ген чувствительности к NB в случаях высокого риска13,14. Исследования показали, что трансгенная коэкспрессия MYCN и LMO1 в PSNS модели рыбок данио не только способствует более раннему началу NB, но и индуцирует широко распространенные метастазы в ткани и органы, которые похожи на участки, обычно наблюдаемые у пациентов с высоким риском NB13. Совсем недавно другой метастатический фенотип NB также наблюдался в более новой модели NB рыбок данио, в которой как MYCN, так и Lin28B, кодирующие РНК-связывающий белок, чрезмерно экспрессируются под контролем промотора dβh16.
Стабильный трансгенный подход у рыбок данио часто используется для изучения того, может ли чрезмерная экспрессия интересующего гена способствовать нормальному развитию и патогенезу заболевания14,15. Этот метод был успешно использован для демонстрации важности нескольких генов и путей к опухолевому NB 6,16,17,18,19,20. В этой статье будет представлено, как была создана трансгенная рыбья линия, которая чрезмерно экспрессирует как MYCN, так и LMO1 в PSNS, и как было продемонстрировано, что сотрудничество этих двух онкогенов ускоряет начало опухолевого NB и метастазирования13. Во-первых, трансгенная линия, которая сверхэкспрессирует EGFP-MYCN под контролем промотора dβh (обозначенная линией MYCN), была разработана путем инъекции конструкции dβh-EGFP-MYCN в одноклеточную стадию эмбрионов AB дикого типа (WT), как описано ранее6,17. Отдельная трансгенная линия, которая сверхэкспрессирует LMO1 в PSNS (обозначенная линией LMO1), была разработана путем коинъекции двух конструкций ДНК, dβh-LMO1 и dβh-mCherry, в эмбрионы WT на стадии одной клетки13. Ранее было продемонстрировано, что коинъекционные двойные конструкции ДНК могут быть коинтегрированы в геном рыбы; поэтому LMO1 и mCherry совместно экспрессируются в клетках PSNS трансгенных животных. Как только введенные эмбрионы F0 достигали половой зрелости, их затем скрещивали с рыбой WT для идентификации положительных рыб с интеграцией трансгенов. Короче говоря, потомство F1 было впервые проверено флуоресцентной микроскопией на экспрессию mCherry в клетках PSNS. Интеграция зародышевой линии LMO1 у mCherry-положительных рыб была дополнительно подтверждена геномной ПЦР и секвенированием. После успешной идентификации каждой трансгенной линии потомство гетерозиготных трансгенных рыб MYCN и LMO1 скрещивалось для получения составной рыбной линии, экспрессирующей как MYCN, так и LMO1 (обозначенный MYCN; Линия LMO1). Опухоленосный MYCN; Рыбу LMO1 контролировали с помощью флуоресцентной микроскопии раз в две недели на предмет наличия метастатических опухолей в областях, удаленных от первичного участка, области межпочечной железы (IRG, эквивалент надпочечников человека)13. Для подтверждения метастазирования опухолей в MYCN; Применены рыбный LMO1, гистологический и иммуногистохимический анализы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Рыбки данио широко использовались в исследованиях в течение последних нескольких десятилетий, особенно в исследованиях рака, по очевидным причинам, таким как простота обслуживания, надежное размножение и явные преимущества для визуализации in vivo1,28.</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом R01 CA240323 (S.Z.) от Национального института рака; грант W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) от Министерства обороны США (DOD); награда V Scholar от V Фонда исследований рака (S.Z.) и грант платформы от Центра биомедицинских открытий Майо (S.Z.); и поддержка со стороны Онкологического центра клиники Майо и Центра индивидуализированной медицины (S.Z.).
Materials
| 3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit | Vector | SK-4100 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific / Acros Organic | 64-19-7 | |
| Agarose GP2 | Midwest Scientific | 009012-36-6 | |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Pel-Freez | P40101 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| BOND Intense R Detection | Leica Biosystems | DS9263 | |
| BOND primary antibody diluent | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | AR9352 | |
| BOND-MAX IHC instrument | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | N/A | fully automated IHC staining system |
| CH211-270H11 BAC clone | BACPAC resources center (BRFC) | N/A | |
| Compound microscope equipped with DP71 camera | Olympus | AX70 | |
| Cytoseal XYL (xylene based mounting medium) | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Eosin | Leica | 3801601 | ready-to-use (no preparation needed) |
| Ethanol | Carolina | 86-1263 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
| Gateway BP Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-100 | |
| Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated) | Dako | E0432 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | HHS-32-1L | |
| HRP Avidin D | Vector | A-2004 | |
| Hydrochloric Acid | Aqua Solutions | 4360-1L | |
| Hydrogen Peroxide, 3% | Fisher Scientific | H324-500 | |
| I-SceI enzyme | New England Biolabs, MA | R0694L | |
| Kanamycin sulfate | Teknova, Inc. | K2150 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 34133 | |
| Lithium Carbonate | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
| Microtome for sectioning | Leica Biosystems | RM2255 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| p3E-polyA | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.) |
| Parafin wax | Surgipath Paraplast | 39603002 | Parrafin to parafin |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 | |
| pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites) | Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany | N/A | a generous gift |
| pDONR 221 gateway donor vector | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
| pDONRP4-P1R donor vector | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift |
| Phenol red, 0.5% | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X | BioRad | 1610780 | |
| Picrosirrius red stain kit | Polysciences | 24901-250 | |
| pME-mCherry | Addgene | 26028 | (DBH construct) |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Roche | 21712520 | |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| RDO Rapid Decalcifier | Apex Enginerring | RDO04 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
| Stereo fluorescence microscope | Leica | MZ10F | |
| Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging | Nikon | SMZ-1500 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs, MA | M0273L | |
| Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor | Sakura | N/A | Model #: VIP-6-A1 |
| Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
| Xylene | Thermo Fisher Scientific | X3P1GAL |
References
- Veldman, M., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Research. 6 (5), 694 (2008).
- Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2010).
- Benjamin, D. C., Hynes, R. O. Intravital imaging of metastasis in adult Zebrafish. BMC Cancer. 17 (1), 660 (2017).
- Kim, I. S., et al. Microenvironment-derived factors driving metastatic plasticity in melanoma. Nature Communications. 8, 14343 (2017).
- Zhu, S., et al. Activated ALK collaborates with MYCN in neuroblastoma pathogenesis. Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).
- Maris, J. M., Hogarty, M. D., Bagatell, R., Cohn, S. L. Neuroblastoma. Lancet. 369 (9579), 2106-2120 (2007).
- Park, J. R., et al. Children’s oncology group’s 2013 blueprint for research: neuroblastoma. Pediatric Blood and Cancer. 60 (6), 985-993 (2013).
- Hoehner, J. C., et al. A developmental model of neuroblastoma: differentiating stroma-poor tumors’ progress along an extra-adrenal chromaffin lineage. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 75 (5), 659-675 (1996).
- Tsubota, S., Kadomatsu, K. Origin and initiation mechanisms of neuroblastoma. Cell and Tissue Research. 372 (2), 211-221 (2018).
- Tolbert, V. P., Matthay, K. K. Neuroblastoma: Clinical and biological approach to risk stratification and treatment. Cell and Tissue Research. 372 (2), 195-209 (2018).
- Maris, J. M. Recent advances in neuroblastoma. New England Journal of Medicine. 362 (23), 2202-2211 (2010).
- Zhu, S., et al. LMO1 Synergizes with MYCN to promote neuroblastoma initiation and metastasis. Cancer Cell. 32, 310-323 (2017).
- Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Tao, T., et al. LIN28B regulates transcription and potentiates MYCN-induced neuroblastoma through binding to ZNF143 at target gene promotors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (28), 16516-16526 (2020).
- Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (97), e52567 (2015).
- Zhang, X., et al. Critical role for GAB2 in neuroblastoma pathogenesis through the promotion of SHP2/MYCN cooperation. Cell Reports. 18 (12), 2932-2942 (2017).
- Zimmerman, M. W., et al. MYC drives a subset of high-risk pediatric neuroblastomas and is activated through mechanisms including enhancer hijacking and focal enhancer amplification. Cancer Discovery. 8 (3), 320-335 (2018).
- Koach, J., et al. Drugging MYCN oncogenic signaling through the MYCN-PA2G4 binding interface. 암 연구학. 79 (21), 5652-5667 (2019).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- DuBois, S. G., et al. Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival. Journal of pediatric hematology/oncology. 21 (3), 181-189 (1999).
- Wattrus, S. J., Zon, L. I. Stem cell safe harbor: The hematopoietic stem cell niche in zebrafish. Blood Advances. 2 (21), 3063-3069 (2018).
- Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicologic Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: Zebrafish and vertebrate immunity. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
- Junqueira, L. C., Cossermelli, W., Brentani, R. Differential staining of collagens type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy. Archivum histologicum Japonicum (Nihon Soshikigaku Kiroku). 41 (3), 267-274 (1978).
- Sweat, F., Puchtler, H., Rosenthal, S. I. Sirius red F3BA as a stain for connective tissue. Archives of Pathology. 78, 69-72 (1964).
- Ignatius, M. S., Hayes, M., Langenau, D. M. In vivo imaging of cancer in zebrafish. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 219-237 (2016).
- Howe, C. K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 20 (5), 263-273 (2020).
- Yoganantharjah, P., Gibert, Y. The Use of the zebrafish model to aid in drug discovery and target validation. Current Topics in Medicinal Chemistry. 17 (18), 2041-2055 (2018).
- Ignatius, M. S., et al. In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 21 (5), 680-693 (2012).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Ahmed, S., et al. Neuroblastoma with orbital metastasis: ophthalmic presentation and role of ophthalmologists. Eye. 20 (4), 466-470 (2006).
- Papaioannou, G., McHugh, K. Neuroblastoma in childhood: review and radiological findings. Cancer Imaging Society. 5 (1), 116-127 (2005).
- Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
- Amores, A., et al. Zebrafish hox clusters and vertebrate genome evolution. Science. 282 (5394), 1711-1714 (1998).
- Postlethwait, J. H., et al. Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map. Nature Genetics. 18 (4), 345-349 (1998).
- Opazo, J. C., et al. Whole-genome duplication and the functional diversification of teleost fish hemoglobins. Molecular Biology and Evolution. 30 (1), 140-153 (2013).
