Zebrafisk modell av Neuroblastom metastasering
Summary
Detta dokument introducerar metoden att utveckla, karakterisera och spåra i realtid tumör metastasering i zebrafisk modell av neuroblastom, särskilt i den transgena zebrafisk linjen med överuttryck av MYCN och LMO1, som utvecklar metastasering spontant.
Abstract
Zebrafisk har dykt upp som en viktig djurmodell för att studera mänskliga sjukdomar, särskilt cancer. Tillsammans med den robusta transgena och genomredigeringstekniken som tillämpas i zebrafiskmodellering, gör det enkla underhållet, högvkastande produktivitet och kraftfull levande avbildning helt och hållet zebrafisken till ett värdefullt modellsystem för att studera metastasering och cellulära och molekylära baser som ligger till grund för denna process in vivo. Den första zebrafisk neuroblastom (OBS) modellen av metastasering utvecklades genom att överuttrycka två onkogener, MYCN och LMO1, under kontroll av dopamin-beta-hydroxylas (dβh) promotorn. Co-overexpressed MYCN och LMO1 ledde till minskad latens och ökad penetrance av neuroblastomagenesis, liksom accelererade avlägsna metastasering av tumör celler. Denna nya modell upprepar på ett tillförlitligt sätt många nyckeldrag i human metastaserad NB, inklusive medverkan av kliniskt relevanta och metastaseringsrelaterade genetiska förändringar. naturlig och spontan utveckling av metastasering in vivo; och bevarade platser för metastaser. Därför har zebrafiskmodellen unika fördelar för att dissekera den komplexa processen med tumörmetastasering in vivo.
Introduction
Zebrafisk har använts flitigt och tillämpats på flera forskningsområden, särskilt vid cancer. Denna modell ger många fördelar – såsom dess robusta reproduktion, kostnadseffektivt underhåll och mångsidig visualisering av tumörtillväxt och metastasering – som alla gör zebrafisk till ett kraftfullt verktyg för att studera och undersöka de cellulära och molekylära baserna för tumorigenesis och metastasering. Nya tekniker för storskalig genomkartläggning, transgenes, gener överuttryck eller knockout, celltransplantation och kemiska skärmar har enormt ökat kraften hos zebrafiskmodellen1. Under de senaste åren har många zebrafisklinjer utvecklats för att studera tumorigenesis och metastasering av en mängd olika mänskliga cancerformer, inklusive men inte begränsat till leukemi, melanom, rabdomyosarkom och hepatocellulärt karcinom2,3,4,5. Dessutom genererades den första zebrafiskmodellen av neuroblastom (OBS) genom att överuttrycka MYCN, en onkogen, i det perifera sympatiska nervsystemet (PSNS) under kontroll av dopamin-beta-hydroxylas (dβh) promotorn. Med denna modell visades det ytterligare att aktiverade ALK kan synergisera med MYCN för att påskynda tumör debuten och öka tumör penetrance in vivo6.
NB härleds från sympathoadrenal härstamning av neurala vapen celler, och är en mycket metastaserad cancer hos barn7. Det är ansvarig för 10% av pediatrisk cancerrelaterad död8. Allmänt metastasized vid diagnos, NB kan presenteras kliniskt som tumörer främst med ursprung längs kedjan av sympatiska ganglier och binjure medulla av PSNS9,10. MYCN förstärkning är ofta associerad med dåliga resultat i NB patienter11,12. Dessutom har LMO1 identifierats som en kritisk NB mottaglighet gen i högriskfall13,14. Studier fann att det transgena uttryck av MYCN och LMO1 i PSNS av zebrafiskmodellen inte bara främjar tidigare uppkomst av NB, men inducerar också utbredd metastasering till vävnader och organ som liknar platser som vanligtvis ses hos patienter med högrisk NB13. Helt nyligen har en annan metastaserad fenotyp av NB också observerats i en nyare zebrafiskmodell av NB, där både MYCN och Lin28B, som kodar ett RNA-bindande protein, överuttrycks under kontroll av dβhpromotorn16.
Det stabila transgena tillvägagångssättet hos zebrafisk används ofta för att studera om överuttryck av en gen av intresse kan bidra till normal utveckling och sjukdomspatogenes14,15. Denna teknik har framgångsrikt använts för att visa vikten av flera gener och vägar till NB tumorigenesis6,16,17,18,19,20. Detta dokument kommer att introducera hur den transgena fisklinjen som överuttrycker både MYCN och LMO1 i PSNS skapades och hur det visades att samarbetet mellan dessa två onkogener påskyndar uppkomsten av NB tumorigenesis och metastasering13. För det första utvecklades den transgena linje som överuttrycker EGFP-MYCN under kontroll av dβhpromotorn (utsedd MYCN-linje) genom att dβh-EGFP-MYCN konstrueras i encellsstadiet av embryon av vildtyp (WT) AB, som tidigare beskrivits6,17. En separat transgen linje som överuttrycker LMO1 i PSNS (betecknad LMO1-linje) utvecklades genom att mynta två DNA-konstruktioner, dβh-LMO1 och dβh-mCherry, i WT-embryon i encellssteg13. Det har tidigare visats att myntinkastade dubbla DNA-konstruktioner kan cointegreras i fiskgenomet; Därför uttrycks LMO1 och mCherry i PSNS-cellerna hos de transgena djuren. När de injicerade F0 embryon nådde sexuell mognad, de sedan över-korsas med WT fisk för identifiering av positiva fisk med transgene(s) integration. Kort, F1 avkomman först screenades av fluorescerande mikroskopi för mCherry uttryck i PSNS celler. Den bakteriella integrationen av LMO1 i mCherry-positiva fisk bekräftades ytterligare av genomisk PCR och sekvensering. Efter framgångsrik identifiering av varje transgen linje interbred avkomman av heterozygous MYCN och LMO1 transgen fisk för att generera en sammansatt fisklinje som uttrycker både MYCN och LMO1 (betecknad MYCN; LMO1-linjen). Tumörbärande MYCN; LMO1 fisk övervakades av fluorescerande mikroskopi varannan vecka för bevis på ögonbevarande tumörer i regionerna avlägset till den primära platsen, interrenal körtel regionen (IRG, zebrafisk motsvarighet till mänskliga binjuren)13. För att bekräfta metastasering av tumörer i MYCN; LMO1 fisk, histologiska och immunohistochemical analyser tillämpades.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafisk har använts ofta i forskning under de senaste decennierna, särskilt inom cancerforskning, av uppenbara skäl, såsom dess enkla underhåll, robust reproduktion och tydliga fördelar för in vivo imaging1,28. Zebrafiskmodellen kan lätt manipuleras embryonalt på grund av deras externa befruktning och utveckling, som kompletterar väl till däggdjursmodellorganismer, såsom råttor och möss, för storskaliga genetiska studie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett bidrag R01 CA240323 (S.Z.) från National Cancer Institute; ett bidrag W81XWH-17-1-0498 (S.Z.) från Förenta staternas försvarsdepartement (DoD); en V Scholar-utmärkelse från V Foundation for Cancer Research (S.Z.) och ett plattformsbidrag från Mayo Center for Biomedical Discovery (S.Z.); och stöd från Mayo Clinic Cancer Center och Center for Individualized Medicine (S.Z.).
Materials
| 3,3’-Diaminobenzidine (DAB) Vector Kit | Vector | SK-4100 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific / Acros Organic | 64-19-7 | |
| Agarose GP2 | Midwest Scientific | 009012-36-6 | |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody | Pel-Freez | P40101 | |
| Avidin/Biotin Blocking Kit | Vector | SP-2001 | |
| BOND Intense R Detection | Leica Biosystems | DS9263 | |
| BOND primary antibody diluent | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | AR9352 | |
| BOND-MAX IHC instrument | Leica Biosystems Newcastle, Ltd. | N/A | fully automated IHC staining system |
| CH211-270H11 BAC clone | BACPAC resources center (BRFC) | N/A | |
| Compound microscope equipped with DP71 camera | Olympus | AX70 | |
| Cytoseal XYL (xylene based mounting medium) | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Eosin | Leica | 3801601 | ready-to-use (no preparation needed) |
| Ethanol | Carolina | 86-1263 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Applied Science, IN | 11681834001 | |
| Gateway BP Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11789-020 | |
| Gateway LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-100 | |
| Goat anti-Rb secondary antibody (Biotinylated) | Dako | E0432 | |
| Hematoxylin Solution, Harris Modified | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | HHS-32-1L | |
| HRP Avidin D | Vector | A-2004 | |
| Hydrochloric Acid | Aqua Solutions | 4360-1L | |
| Hydrogen Peroxide, 3% | Fisher Scientific | H324-500 | |
| I-SceI enzyme | New England Biolabs, MA | R0694L | |
| Kanamycin sulfate | Teknova, Inc. | K2150 | |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 34133 | |
| Lithium Carbonate | Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC | 554-13-2 | |
| Microtome for sectioning | Leica Biosystems | RM2255 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404006 | |
| p3E-polyA | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift (Please refer to webpage http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page to obtain material, which is freely distrubted as described.) |
| Parafin wax | Surgipath Paraplast | 39603002 | Parrafin to parafin |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | A11313 | |
| pDEST vector (modified destination vector containing I-SceI recognition sites) | Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany | N/A | a generous gift |
| pDONR 221 gateway donor vector | Thermo Fisher Scientific | 12536-017 | |
| pDONRP4-P1R donor vector | Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah | N/A | a generous gift |
| Phenol red, 0.5% | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X | BioRad | 1610780 | |
| Picrosirrius red stain kit | Polysciences | 24901-250 | |
| pME-mCherry | Addgene | 26028 | (DBH construct) |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Roche | 21712520 | |
| QIAprep Spin MiniPrep Kit | Qiagen | 27104 | |
| RDO Rapid Decalcifier | Apex Enginerring | RDO04 | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma Aldrich | 26628-22-8 | |
| Stereo fluorescence microscope | Leica | MZ10F | |
| Stereoscopic fluorescence microscope equipped with a digital sight DS-U1 camera for imaging | Nikon | SMZ-1500 | |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs, MA | M0273L | |
| Tissue-Tek VIP® 6 AI Vacuum Infiltration Processor | Sakura | N/A | Model #: VIP-6-A1 |
| Tricaine-S | Western Chemical Incorporated | 20513 | |
| Xylene | Thermo Fisher Scientific | X3P1GAL |
References
- Veldman, M., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatric Research. 64, 470-476 (2008).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Research. 6 (5), 694 (2008).
- Ethcin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish as a model for the study of human cancer. Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2010).
- Benjamin, D. C., Hynes, R. O. Intravital imaging of metastasis in adult Zebrafish. BMC Cancer. 17 (1), 660 (2017).
- Kim, I. S., et al. Microenvironment-derived factors driving metastatic plasticity in melanoma. Nature Communications. 8, 14343 (2017).
- Zhu, S., et al. Activated ALK collaborates with MYCN in neuroblastoma pathogenesis. Cancer Cell. 21 (3), 362-373 (2012).
- Maris, J. M., Hogarty, M. D., Bagatell, R., Cohn, S. L. Neuroblastoma. Lancet. 369 (9579), 2106-2120 (2007).
- Park, J. R., et al. Children’s oncology group’s 2013 blueprint for research: neuroblastoma. Pediatric Blood and Cancer. 60 (6), 985-993 (2013).
- Hoehner, J. C., et al. A developmental model of neuroblastoma: differentiating stroma-poor tumors’ progress along an extra-adrenal chromaffin lineage. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 75 (5), 659-675 (1996).
- Tsubota, S., Kadomatsu, K. Origin and initiation mechanisms of neuroblastoma. Cell and Tissue Research. 372 (2), 211-221 (2018).
- Tolbert, V. P., Matthay, K. K. Neuroblastoma: Clinical and biological approach to risk stratification and treatment. Cell and Tissue Research. 372 (2), 195-209 (2018).
- Maris, J. M. Recent advances in neuroblastoma. New England Journal of Medicine. 362 (23), 2202-2211 (2010).
- Zhu, S., et al. LMO1 Synergizes with MYCN to promote neuroblastoma initiation and metastasis. Cancer Cell. 32, 310-323 (2017).
- Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nature Reviews Genetics. 2 (12), 956-966 (2001).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).
- Tao, T., et al. LIN28B regulates transcription and potentiates MYCN-induced neuroblastoma through binding to ZNF143 at target gene promotors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (28), 16516-16526 (2020).
- Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic zebrafish transgenesis for functional genomic analysis of candidate cooperative genes in tumor pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (97), e52567 (2015).
- Zhang, X., et al. Critical role for GAB2 in neuroblastoma pathogenesis through the promotion of SHP2/MYCN cooperation. Cell Reports. 18 (12), 2932-2942 (2017).
- Zimmerman, M. W., et al. MYC drives a subset of high-risk pediatric neuroblastomas and is activated through mechanisms including enhancer hijacking and focal enhancer amplification. Cancer Discovery. 8 (3), 320-335 (2018).
- Koach, J., et al. Drugging MYCN oncogenic signaling through the MYCN-PA2G4 binding interface. 암 연구학. 79 (21), 5652-5667 (2019).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- DuBois, S. G., et al. Metastatic sites in stage IV and IVS neuroblastoma correlate with age, tumor biology, and survival. Journal of pediatric hematology/oncology. 21 (3), 181-189 (1999).
- Wattrus, S. J., Zon, L. I. Stem cell safe harbor: The hematopoietic stem cell niche in zebrafish. Blood Advances. 2 (21), 3063-3069 (2018).
- Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicologic Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
- Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: Zebrafish and vertebrate immunity. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
- Junqueira, L. C., Cossermelli, W., Brentani, R. Differential staining of collagens type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy. Archivum histologicum Japonicum (Nihon Soshikigaku Kiroku). 41 (3), 267-274 (1978).
- Sweat, F., Puchtler, H., Rosenthal, S. I. Sirius red F3BA as a stain for connective tissue. Archives of Pathology. 78, 69-72 (1964).
- Ignatius, M. S., Hayes, M., Langenau, D. M. In vivo imaging of cancer in zebrafish. Advances in Experimental Medicine and Biology. 916, 219-237 (2016).
- Howe, C. K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 20 (5), 263-273 (2020).
- Yoganantharjah, P., Gibert, Y. The Use of the zebrafish model to aid in drug discovery and target validation. Current Topics in Medicinal Chemistry. 17 (18), 2041-2055 (2018).
- Ignatius, M. S., et al. In vivo imaging of tumor-propagating cells, regional tumor heterogeneity, and dynamic cell movements in embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 21 (5), 680-693 (2012).
- Stoletov, K., Montel, V., Lester, R. D., Gonias, S. L., Klemke, R. High-resolution imaging of the dynamic tumor cell vascular interface in transparent zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (44), 17406-17411 (2007).
- Ahmed, S., et al. Neuroblastoma with orbital metastasis: ophthalmic presentation and role of ophthalmologists. Eye. 20 (4), 466-470 (2006).
- Papaioannou, G., McHugh, K. Neuroblastoma in childhood: review and radiological findings. Cancer Imaging Society. 5 (1), 116-127 (2005).
- Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27 (30), 4242-4248 (2008).
- Amores, A., et al. Zebrafish hox clusters and vertebrate genome evolution. Science. 282 (5394), 1711-1714 (1998).
- Postlethwait, J. H., et al. Vertebrate genome evolution and the zebrafish gene map. Nature Genetics. 18 (4), 345-349 (1998).
- Opazo, J. C., et al. Whole-genome duplication and the functional diversification of teleost fish hemoglobins. Molecular Biology and Evolution. 30 (1), 140-153 (2013).
