Summary
تم استخدام نظام تحليل التدفق للمقايسات متعددة الفأس القائمة على الخرز والتي توفر قراءات من اثنين من المراسلين لتطوير المقايسات متعددة المصلية وتحييد الأجسام المضادة التي يمكن أن تقيس في وقت واحد تحييد الأجسام المضادة IgG و IgM للسارس-CoV-2.
Abstract
وقد أكد وباء COVID-19 على الحاجة إلى طرق سريعة عالية الإنتاجية للكشف المصلي الحساس والمحدد للعدوى بمسببات الأمراض الجديدة، مثل السارس-CoV-2. يمكن أن يكون الاختبار المصلي المتعدد مفيدا بشكل خاص لأنه يمكنه تحليل الأجسام المضادة في وقت واحد إلى مستضدات متعددة تعمل على تحسين تغطية مسببات الأمراض ، وضوابط للتغير في الكائن الحي واستجابة المضيف الفردية. هنا نصف السارس-CoV-2 IgG 3-plex الفلورسنت المقايسة القائمة على المجهرية التي يمكن الكشف عن كل من IgM وIgG الأجسام المضادة لثلاثة مستضدات السارس-CoV-2 الرئيسية-ارتفاع (S) البروتين، ارتفاع أنجيوتنسين تحويل إنزيم-2 (ACE2) مستقبل ملزم المجال (RBD)، وnucleocapsid (Nc). وتبين أن الفحص له أداء مماثل للمساحة المرجعية للسارس-CoV-2 ل IgG في المصل التي تم الحصول عليها في ≥21 يوما من ظهور الأعراض ولكن كانت حساسيتها أعلى مع العينات التي تم جمعها في ≤5 أيام من ظهور الأعراض. علاوة على ذلك ، باستخدام ACE2 القابل للذوبان في شكل مقايسة تحييد ، تم إثبات تثبيط ربط الأجسام المضادة ل S و RBD.
Introduction
وقد أكد وباء COVID-19 على أهمية القدرة على التطور السريع والتنفيذ السريع وعالي الإنتاجية والاختبارات المصلية عالية الأداء التي يمكن استخدامها لتشخيص ومراقبة مسببات الأمراض الجديدة مثل السارس-CoV-2. يمكن أن يكون الاختبار المصلي المتعدد مفيدا للغاية في الجائحة ، حيث يمكنه تحليل الأجسام المضادة في وقت واحد إلى مستضدات متعددة ، مما يوفر تغطية واسعة للعوامل الممرضة وضوابط للتغير في الكائن الحي واستجابة المضيف للعدوى. تم مؤخرا الإبلاغ عن تطوير م المقايسة الفلورية المتعددة القائمة على حبة ، السارس -CoV-2 IgG 3Flex (3Flex) ، التي يمكنها اكتشاف الأجسام المضادة للبروتين (S) ، وانزيم تحويل الأنجيوتنسين - 2 (ACE2) (ACE2) المجال الملزم للمستقبلات (RBD) ، وnucleocapsid (Nc) من SARS-CoV-2مؤخرا 1. 3وبين أن أداء الفليكس مماثل لمرجعية من فحص سارس-CoV-2 IgG للمصل تم الحصول عليه في ≥21 يوما من بداية الأعراض ولكن كانت حساسيته أعلى مع العينات التي تم جمعها في ≤5 أيام من ظهور الأعراض. بالإضافة إلى ذلك، تم إثبات تثبيط ربط الأجسام المضادة لمضادات S و RBD باستخدام ACE2 القابل للذوبان في تنسيق فحص تحييد. وقد اعتمدت على نطاق واسع التكنولوجيا Multix حبة على أساس كتكنولوجيا ثبت لاختبار serological multix ولها مزايا متميزة للفحص على نطاق واسع، بما في ذلك وقت قصير إلى نتائج، ومتطلبات عينة صغيرة، وانخفاضالعمالة 2،3،4.
في الآونة الأخيرة ، أصبح أداة جديدة لتحليل التدفق متاحة توفر نفس القدرة عالية الضفيرة وعالية الإنتاجية للنظام التي أظهرتها في العمل السابق1، ولكن مع فائدة إضافية من قناتين مراسلتين. القدرة على قياس اثنين من إشارات مراسل الفلورسنت في رد فعل واحد يسمح بتقييم نتيجتين لكل تحليل لكل عينة ومثالية لتطبيقات isotyping، والتي عادة ما يجب أن يتم في ردود فعل منفصلةالآبار 5. توفر قدرة المراسل المزدوج ضعف البيانات لكل عينة في نصف عدد آبار التفاعل مع نصف متطلبات حجم العينة ، وبالتالي لديها ميزة واضحة على أنظمة المراسلين الفرديين. تفصل هذه الدراسة بروتوكول الفحص المصلي القياسي وتصف التكيف مع م المقايسة المحايدة. بالإضافة إلى ذلك، يصف هذا التقرير تحويل المقايسة المراسلة الواحدة إلى مقايسة سيرولوجية مزدوجة للمراسل، وبعد ذلك، اختبار تحييد المراسل المزدوج، لقياس تحييد الأجسام المضادة لكل من IgG وIgM isotypes ضد مستضدات السارس-CoV-2 S وRBD وNc في وقت واحد. يتم توفير نظرة عامة مرئية على بروتوكول المقايسة في الشكل 1.
Protocol
واستخدمت في هذه الدراسة عينات مصل بشري متبقية سبق اختبارها لإجراء تحليلات تشخيصية للسارس-CoV-2، ووافق عليها مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة روتشستر.
1. الكواشف والمعدات
- الحصول على مستضدات الفيروس التاجي وIgG الإنسان وIgM من مصادر تجارية.
- الحصول على مجموعات حبة التحكم في المقايسة (AC) (45 و 220) من بائع الأداة. مجموعة حبة AC 45 شاشات متوسط كثافة الفلورسينس (MFI) جمع على قناة مراسل واحد (RP1) الصكوك. مجموعة حبة AC 220 تراقب مجموعة MFI على قناة المراسل الثاني (RP2).
- الحصول على الأجسام المضادة الكشف والفيرا أرنب مستضد محددة والأجسام المضادة المستخدمة لتأكيد اقتران.
- إجراء الكشف مع الأجسام المضادة التي تحمل علامة البيوتين إما مع streptavidin، R-phycoerythrin المصاحبة (SAPE) أو اقتران streptavidin من الفلوروفوري سوبر برايت 436 (SASB؛ الإثارة في 405 نانومتر (نانومتر) والانبعاثات في 436 نانومتر).
- الحصول على بروتين ACE2 البشري (أي مستقبلات السارس). قبل الاستخدام، إعادة ترطيب بروتين ACE2 lyophilized عن طريق الذوبان إلى تركيز 1 ملغم / مل في الماء الخالي من النيوكليز (غير المعالجة من DEPC، autoclaved و 0.2-μm المعقمة تصفيتها) وتخزينها في 4 درجة مئوية.
- أداء جميع ردود الفعل في 96 جيدا غير ملزمة السطح (NBS) أسود لوحات مسطحة القاع. ختم لوحات مع 96 جيدا microplate الألومنيوم ختم الشريط لخطوات حضانة المقايسة. استخدام فاصل لوحة المغناطيسي لخطوات غسل المقايسة.
2. إعداد حبات التحكم المقترنة بالمضاد والأجسام المضادة
- زوجين بشكل مشترك المغناطيسي, البوليسترين, ومجموعات ميكروسفير مرمزة بالألوان (6.5-ميكرومتر قطر) مع S, RBD, وNNC المستضدات كما هو موضح في كاميرون وآخرون. وتقترن مستضدات فيروس كورونا في 10 pmol/106 حبات (S) و 100 pmol/106 حبات (RBD وNc). يتم إنشاء الخرز التحكم مقرونة IgG الإنسان أو IgM كما هو موضح سابقا1. ويقترن IgG وIgM في 5 ميكروغرام /106 حبات.
- بعد اقتران، وتحديد تركيزات حبة وتمييع كل مخزون إلى 1 × 106 حبات / مل باستخدام الإجراءات الموصوفة6.
- تنفيذ تأكيد اقتران مستضد مع الأجسام المضادة المستضد محددة من أرنب أومع سيرا الإنسان إيجابية كما هو موضح في كاميرون وآخرون.
- تأكيد اقتران IgG الإنسان مع مضادات البيوتينية المضادة للإنسان المقايسة / الكواشف الكشف SAPE، واقتران IgM مع فيكوريثرين (PE) المسمى الماعز المضادة للإنسان IgM.
ملاحظة: يتم إجراء تأكيد اقتران باستخدام المعايرة من مصل البروتين محددة أو الأجسام المضادة، لأن التركيز الأمثل لاستخدامها لهذه الكواشف غير معروف. بالنسبة للمصل، يتم استخدام تخفيفات الطي التسلسلية بينما تستخدم سلسلة تخفيف الأجسام المضادة التي يتم توفيرها كمخزونات ملغم/مل.
- تأكيد اقتران IgG الإنسان مع مضادات البيوتينية المضادة للإنسان المقايسة / الكواشف الكشف SAPE، واقتران IgM مع فيكوريثرين (PE) المسمى الماعز المضادة للإنسان IgM.
- خرز التحكم في المقايسة المخفف (AC) التي تراقب جمع MFI في قناتي المراسلة إلى تركيز 1 × 10حبات / مل قبل الاستخدام في خلطات حبة متعددة.
3. الطازجة متعددة حبة مزيج إعداد
- إعداد حبات متعددة يمزج طازجة كل يوم من حبة الفردية مقرونة والسيطرة على مخزون حبة في 1 × 106 حبات / مل.
ملاحظة: يتم إعداد خلطات حبة Multix لتسليم 2500 حبة لكل منطقة حبة في وحدة تخزين 50 ميكرولتر. يتم وصف حسابات لكيفية إعداد يمزج حبة multix لأي عدد من ردود الفعل في بلوق التي نشرتها أنجيلوني (2020)6.
4. عينة تخفيف
- إعداد 1:100 تخفيف عينة المصل عن طريق خلط 10 ميكروغرام من المصل في 990 ميكروغرام من المالحة العازلة الفوسفات (PBS) التي تحتوي على 0.05٪ توين 20، 0.02٪ من ثاني أكسيد الصوديوم، و 1٪ من ألبوم مصل البقر (BSA) (PBS-TBN العازلة).
- تمييع العينات مرة أخرى 10 أضعاف بإضافة 20 ميكرولتر من تخفيف 1:100 إلى 180 ميكرولتر من PBS-TBN.
ملاحظة: تتكون عينات المصل من سيرا سالبة، من عينات تم جمعها في عام 2019 قبل وباء COVID-19، وسيرا إيجابية من المرضى المصابين بالسارس-CoV-2 PCR، الذين يمثلون عوارض مضادة منخفضة وعالية. تم جمع عينات إيجابية بين 3 ≈ إلى 60 > أيام من ظهور الأعراض (DFSO). يتم تخفيف جميع عينات المصل وIgG جردت السيطرة السلبية سيرا إلى 1:1000 على النحو المبين أدناه. بالنسبة لمقايسات الإبطال، يتم تخفيف sera 1:500 كما هو موضح في بروتوكولات التحييد أدناه (القسمان 6 و8).
5. بروتوكول واحد المراسل الفحص المصلي
- إضافة 50 ميكرولتر من مزيج حبة multix لكل بئر معين من لوحة microtiter غير ملزمة بشكل جيد 96.
- ماصة 50 ميكرولتر من مصل 1:1000 أو برنامج تلفزيوني-TBN في الآبار المناسبة; التمييع النهائي للمصل في البئر هو 1:2000.
- تغطية لوحة مع ختم احباط microplate واحتضان على شاكر لوحة ساخنة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز في 600 دورة في الدقيقة.
- إزالة لوحة من شاكر لوحة ووضعها على فاصل لوحة المغناطيسي لمدة 2 دقيقة لفصل الخرز من خليط رد الفعل.
- مع الاحتفاظ لوحة على المغناطيس، وإزالة ختم احباط، عكس بعناية لوحة على حاوية النفايات، ونفض الغبار بلطف supernatant من الآبار.
- لطخة لوحة على الورق ماصة في حين لا يزال عقد لوحة على المغناطيس.
- غسل آبار التفاعل كما هو موضح أدناه (أول غسل حضانة بعد العينة).
- إزالة لوحة من المغناطيس لوحة وإضافة 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-TBN إلى كل بئر.
- يغطى الطبق بختم رقائق طازج ويهز عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين عند 600 دورة في الدقيقة.
- إزالة لوحة من شاكر لوحة ووضعها على المغناطيس لوحة لمدة 2 دقيقة لفصل الخرز من خليط رد الفعل.
- مع الاحتفاظ لوحة على المغناطيس، وإزالة ختم احباط، عكس بعناية لوحة على حاوية النفايات، ونفض الغبار بلطف supernatant من الآبار.
- لطخة لوحة على الورق ماصة في حين لا يزال عقد لوحة على المغناطيس.
- غسل آبار التفاعل كما هو موضح أدناه (غسل الحضانة الثاني بعد العينة).
- إزالة لوحة من المغناطيس لوحة وإضافة 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-TBN إلى كل بئر.
- يغطى الطبق بختم رقائق طازج ويهز عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين عند 600 دورة في الدقيقة.
- إزالة لوحة من شاكر لوحة ووضعها على المغناطيس لوحة لمدة 2 دقيقة لفصل الخرز من خليط رد الفعل.
- مع الاحتفاظ لوحة على المغناطيس، وإزالة ختم احباط، عكس بعناية لوحة على حاوية النفايات، ونفض الغبار بلطف supernatant من الآبار.
- إزالة لوحة من المغناطيس.
- جعل مزيج جديد من البيوتين المضادة للإنسان IgG مع SAPE عن طريق تمييع الأجسام المضادة إلى 0.62 ميكروغرام / مل وSAPE إلى 1 ميكروغرام / مل. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر.
- تغطية لوحة مع ختم احباط microplate واحتضان على شاكر لوحة ساخنة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز في 600 دورة في الدقيقة.
- إزالة لوحة من شاكر لوحة ووضعها على فاصل لوحة المغناطيسي لمدة 2 دقيقة لفصل الخرز من خليط رد الفعل.
- مع الاحتفاظ لوحة على المغناطيس، وإزالة ختم احباط، عكس بعناية لوحة على حاوية النفايات، ونفض الغبار بلطف supernatant من الآبار.
- لطخة لوحة على الورق ماصة في حين لا يزال عقد لوحة على المغناطيس.
- غسل آبار التفاعل كما هو موضح أدناه (أول غسل حضانة للأجسام المضادة بعد الكشف).
- إزالة لوحة من المغناطيس لوحة وإضافة 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-TBN إلى كل بئر.
- يغطى الطبق بختم رقائق طازج ويهز عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين عند 600 دورة في الدقيقة.
- إزالة لوحة من شاكر لوحة ووضعها على المغناطيس لوحة لمدة 2 دقيقة لفصل الخرز من خليط رد الفعل.
- مع الاحتفاظ لوحة على المغناطيس، وإزالة ختم احباط، عكس بعناية لوحة على حاوية النفايات، ونفض الغبار بلطف supernatant من الآبار.
- لطخة لوحة على الورق ماصة في حين لا يزال عقد لوحة على المغناطيس.
- غسل آبار التفاعل كما هو موضح أدناه (غسل حضانة الأجسام المضادة الثانية بعد الكشف).
- إزالة لوحة من المغناطيس لوحة وإضافة 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-TBN إلى كل بئر.
- يغطى الطبق بختم رقائق طازج ويهز عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين عند 600 دورة في الدقيقة.
- إزالة لوحة من شاكر لوحة ووضعها على فاصل لوحة المغناطيسي لمدة 2 دقيقة لفصل الخرز من خليط رد الفعل.
- مع الاحتفاظ لوحة على المغناطيس، وإزالة ختم احباط، عكس بعناية لوحة على حاوية النفايات، ونفض الغبار بلطف supernatant من الآبار.
- إزالة لوحة من المغناطيس.
- إضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-TBN إلى كل بئر.
- يغطى بختم الرقائق ويهز لمدة دقيقتين عند 37 درجة مئوية.
- إزالة لوحة من شاكر لوحة. ثم إزالة ختم احباط وقراءة 50 ميكرولتر من كل بئر على محلل تدفق وفقا لدليل المستخدم. ويرد أدناه وصف موجز.
- حدد القائمة المنسدلة في الزاوية العلوية اليسرى من الشاشة وانتقل إلى تكوين اللوحة.
- حدد تشغيل لوحة.
- حدد رمز الإخراج لإخراج حامل اللوحة.
- قم بتحميل اللوحة على حامل اللوحة وحدد رمز السحب لسحب حامل اللوحة.
- حدد رمز تشغيل لتشغيل اللوحة.
6. بروتوكول واحد تحييد المراسل المقايسة
- إعداد مزيج حبة متعددة جديدة كما هو موضح في القسم 3 أعلاه.
- تمييع المريض والسيطرة سيرا 1:500 على النحو التالي.
- تمييع المصل 1:100 عن طريق خلط 10 ميكرولتر من المصل إلى 990 ميكرولتر من PBS-TBN.
- تمييع المصل 5 أضعاف أخرى عن طريق إضافة 40 ميكرولتر من مصل 1:100 إلى 160 ميكرولتر من PBS-TBN.
- إضافة 50 ميكرولتر من مزيج حبة multix لكل بئر معين من لوحة microtiter غير ملزمة بشكل جيد 96.
- إضافة 25 ميكرولتر من 2 ميكروغرام / مل ACE2 التخفيف إلى كل بئر.
- تغطية لوحة مع ختم احباط microplate واحتضان على شاكر لوحة ساخنة في 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة مع اهتزاز في 600 دورة في الدقيقة.
- إزالة لوحة من شاكر لوحة وإزالة ختم احباط.
- إضافة 25 ميكرولتر من مصل 1:500 أو برنامج تلفزيوني-TBN إلى الآبار المخصصة.
- تغطية لوحة مع ختم احباط microplate واحتضان على شاكر لوحة ساخنة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز في 600 دورة في الدقيقة.
- فيما تبقى من إجراء الفحص اتبع الخطوات 5.4 إلى 5.18.5 كما هو موضح أعلاه.
7. تحويل إلى المراسل المزدوج IgG و IgM المقايسة المصلية
- إعداد حبات مستضد مقرونة كما هو موضح في القسم 2 أعلاه.
ملاحظة: يتم تضمين مجموعة حبة إضافية، إلى جانب IgM الإنسان، لرصد لإضافة الكواشف الكشف المضادة IgM، فضلا عن مجموعة حبة AC إضافية (220) لرصد جمع MFI لRP2. جميع مخزون الخرز في 1 × 106 حبات / مل لإدراجها في يمزج حبة multix كما هو موضح أدناه. - إعداد حبة متعددة الطازجة يمزج كما هو موضح في القسم 3 أعلاه.
- عينات مصل المخفف وIgG جردت السيطرة السلبية سيرا 1:1000 كما هو موضح في القسم 4 أعلاه.
- إضافة 50 ميكرولتر من مزيج حبة multix لكل بئر معين من لوحة microtiter غير ملزمة بشكل جيد 96.
- ماصة 50 ميكرولتر من مصل 1:1000 أو برنامج تلفزيوني-TBN إلى الآبار المناسبة. التمييع النهائي للمصل في البئر هو 1:2000.
- تغطية لوحة مع ختم احباط microplate واحتضان على شاكر لوحة ساخنة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز في 600 دورة في الدقيقة.
- إزالة لوحة من شاكر لوحة ووضعها على فاصل لوحة المغناطيسي لمدة 2 دقيقة لفصل الخرز من خليط رد الفعل.
- مع الاحتفاظ لوحة على المغناطيس، وإزالة ختم احباط، عكس بعناية لوحة على حاوية النفايات، ونفض الغبار بلطف supernatant من الآبار.
- لطخة لوحة على الورق ماصة في حين لا يزال عقد لوحة على المغناطيس.
- غسل آبار التفاعل كما هو موضح أدناه (أول غسل حضانة بعد العينة).
- إزالة لوحة من المغناطيس لوحة وإضافة 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-TBN إلى كل بئر.
- يغطى الطبق بختم رقائق طازج ويهز عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين عند 600 دورة في الدقيقة.
- إزالة لوحة من شاكر لوحة ووضعها على المغناطيس لوحة لمدة 2 دقيقة لفصل الخرز من خليط رد الفعل.
- مع الاحتفاظ لوحة على المغناطيس، وإزالة ختم احباط، عكس بعناية لوحة على حاوية النفايات، ونفض الغبار بلطف supernatant من الآبار.
- لطخة لوحة على الورق ماصة في حين لا يزال عقد لوحة على المغناطيس.
- غسل الآبار رد فعل مرة أخرى مع PBS-TBN (غسل الحضانة الثانية بعد العينة)، تماما كما هو موضح أعلاه في الخطوات 7.10.1-7.10.5.
- إزالة لوحة من المغناطيس.
- قم بعمل مزيج جديد من كاشفات الكشف مع التركيبة المطلوبة من الكواشف وأضف 50 ميكرولتر أو 100 ميكرولتر لكل بئر.
ملاحظة: تم استخدام خلطات كاشف الكشف التي تحتوي على IgG المضاد للإنسان المترافق مع صبغة المراسلة Brilliant Violet 421 (BV؛ الإثارة عند 405 نانومتر والانبعاثات عند 421 نانومتر) عند 50 ميكرولتر / بئر بسبب الحد من كميات الكواشف المتاحة. وتستخدم جميع خلطات كاشف الكشف الأخرى في 100 ميكرولتر / بئر. - تغطية لوحة مع ختم احباط microplate واحتضان على شاكر لوحة ساخنة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز في 600 دورة في الدقيقة.
- إزالة لوحة من شاكر لوحة ووضعها على فاصل لوحة المغناطيسي لمدة 2 دقيقة لفصل الخرز من خليط رد الفعل.
- مع الاحتفاظ لوحة على المغناطيس، وإزالة ختم احباط، عكس بعناية لوحة على حاوية النفايات، ونفض الغبار بلطف supernatant من الآبار.
- لطخة لوحة على الورق ماصة في حين لا يزال عقد لوحة على المغناطيس.
- غسل آبار التفاعل كما هو موضح أدناه مع PBS-TBN (غسل الأولى بعد الكشف عن حضانة الأجسام المضادة).
- إزالة لوحة من المغناطيس لوحة وإضافة 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-TBN إلى كل بئر.
- يغطى الطبق بختم رقائق طازج ويهز عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين عند 600 دورة في الدقيقة.
- إزالة لوحة من شاكر لوحة ووضعها على فاصل لوحة المغناطيسي لمدة 2 دقيقة لفصل الخرز من خليط رد الفعل.
- مع الاحتفاظ لوحة على المغناطيس، وإزالة ختم احباط، عكس بعناية لوحة على حاوية النفايات، ونفض الغبار بلطف supernatant من الآبار.
- لطخة لوحة على الورق ماصة في حين لا يزال عقد لوحة على المغناطيس.
- غسل الآبار رد الفعل مرة أخرى مع PBS-TBN (غسل الثاني بعد الكشف عن احتضان الأجسام المضادة)، تماما كما هو موضح أعلاه في الخطوات 7.17.1-7.17.5.
- إزالة لوحة من المغناطيس.
- إضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-TBN إلى كل بئر.
- يغطى بختم الرقائق ويهز لمدة دقيقتين عند 37 درجة مئوية.
- إزالة لوحة من شاكر لوحة. ثم إزالة ختم احباط وقراءة 50 ميكرولتر من كل بئر على محلل تدفق كما هو موضح أعلاه في الخطوات 5.18.1-5.18-5.
8. التحويل إلى المقايسة المزدوجة تحييد المراسل
- استخدم الخرز المقترن كما هو موضح في الخطوة 7.1 أعلاه.
- إعداد مزيج حبة multix جديدة كما هو موضح في الخطوة 7.2.
- عينات المصل وIgG جردت السيطرة السلبية سيرا المخفف 1:500 على النحو التالي.
- إعداد تخفيف 1:100 عن طريق خلط 10 ميكرولتر من المصل في 990 ميكرولتر من PBS-TBN.
- تمييع عينات 1:100 مرة أخرى 5 أضعاف بإضافة 40 ميكرولتر من تخفيف 1:100 إلى 160 ميكرولتر من PBS-TBN.
- إضافة 50 ميكرولتر من مزيج حبة multix لكل بئر معين من لوحة microtiter غير ملزمة بشكل جيد 96.
- إضافة 25 ميكرولتر من 2 ميكروغرام / مل ACE2 التخفيف إلى كل بئر.
- تغطية لوحة مع ختم احباط microplate واحتضان على شاكر لوحة ساخنة في 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة مع اهتزاز في 600 دورة في الدقيقة.
- إزالة لوحة من شاكر لوحة وإزالة ختم احباط.
- إضافة 25 ميكرولتر من مصل 1:500 أو برنامج تلفزيوني-TBN إلى الآبار المخصصة.
- تغطية لوحة مع ختم احباط واحتضان على شاكر لوحة ساخنة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز في 600 دورة في الدقيقة.
- إزالة لوحة من شاكر لوحة ووضعها على فاصل لوحة المغناطيسي لمدة 2 دقيقة لفصل الخرز من خليط رد الفعل.
- مع لوحة الاحتفاظ بها على المغناطيس، وإزالة ختم احباط، عكس بعناية لوحة على حاوية النفايات، ونفض الغبار بلطف supernatant من الآبار.
- لطخة لوحة على الورق ماصة في حين لا يزال عقد لوحة على المغناطيس.
- غسل آبار التفاعل كما هو موضح أدناه (أول غسل حضانة عينة آخر).
- إزالة لوحة من المغناطيس لوحة وإضافة 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-TBN إلى كل بئر.
- يغطى الطبق بختم رقائق طازج ويهز عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين عند 600 دورة في الدقيقة.
- إزالة لوحة من شاكر لوحة ووضعها على فاصل لوحة المغناطيسي لمدة 2 دقيقة لفصل الخرز من خليط رد الفعل.
- مع لوحة الاحتفاظ بها على المغناطيس، وإزالة ختم احباط، عكس بعناية لوحة على حاوية النفايات، ونفض الغبار بلطف supernatant من الآبار.
- لطخة لوحة على الورق ماصة في حين لا يزال عقد لوحة على المغناطيس.
- غسل الآبار رد فعل مرة أخرى مع PBS-TBN (غسل الحضانة الثانية بعد العينة)، تماما كما هو موضح أعلاه في الخطوات 8.13.1-8.13.5.
- إزالة لوحة من المغناطيس.
- قم بعمل مزيج جديد من كاشفات الكشف مع التركيبة المطلوبة من الكواشف وأضف 50 ميكرولتر أو 100 ميكرولتر لكل بئر.
ملاحظة: تم استخدام خلطات كاشف الكشف التي تحتوي على IgG المضاد للإنسان المترافق مع صبغة مراسل BV عند 50 ميكرولتر / بئر بسبب الحد من كميات الكواشف المتاحة (انظر جدول المواد). وتستخدم جميع خلطات كاشف الكشف الأخرى في 100 ميكرولتر / بئر. - تغطية لوحة مع ختم احباط microplate واحتضان على شاكر لوحة ساخنة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز في 600 دورة في الدقيقة.
- إزالة لوحة من شاكر لوحة ووضعها على فاصل لوحة المغناطيسي لمدة 2 دقيقة لفصل الخرز من خليط رد الفعل.
- مع لوحة الاحتفاظ بها على المغناطيس، وإزالة ختم احباط، عكس بعناية لوحة على حاوية النفايات، ونفض الغبار بلطف supernatant من الآبار.
- لطخة لوحة على الورق ماصة في حين لا يزال عقد لوحة على المغناطيس.
- غسل آبار التفاعل كما هو موضح أدناه (الأولى كانت بعد حضانة الأجسام المضادة للكشف).
- إزالة لوحة من المغناطيس لوحة وإضافة 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-TBN إلى كل بئر.
- يغطى الطبق بختم رقائق طازج ويهز عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين عند 600 دورة في الدقيقة.
- إزالة لوحة من شاكر لوحة ووضعها على فاصل لوحة المغناطيسي لمدة 2 دقيقة لفصل الخرز من خليط رد الفعل.
- مع لوحة الاحتفاظ بها على المغناطيس، وإزالة ختم احباط، عكس بعناية لوحة على حاوية النفايات، ونفض الغبار بلطف supernatant من الآبار.
- لطخة لوحة على الورق ماصة في حين لا يزال عقد لوحة على المغناطيس.
- غسل آبار رد الفعل مرة أخرى مع PBS-TBN (غسل الثاني بعد الكشف عن احتضان الأجسام المضادة)، تماما كما هو مفصل أعلاه في الخطوات 8.21.1-8.21.5.
- إزالة لوحة من المغناطيس لوحة وإضافة 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-TBN إلى كل بئر.
- يغطى الطبق بختم رقائق طازج ويهز عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين عند 600 دورة في الدقيقة.
- إزالة لوحة من شاكر لوحة ووضعها على فاصل لوحة المغناطيسي لمدة 2 دقيقة لفصل الخرز من خليط رد الفعل.
- مع لوحة الاحتفاظ بها على المغناطيس، وإزالة ختم احباط، عكس بعناية لوحة على حاوية النفايات، ونفض الغبار بلطف supernatant من الآبار.
- إزالة لوحة من المغناطيس.
- إضافة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-TBN إلى كل بئر.
- يغطى بختم الرقائق ويهز لمدة دقيقتين عند 37 درجة مئوية.
- إزالة لوحة من شاكر لوحة. ثم إزالة ختم احباط وقراءة 50 ميكرولتر من كل بئر على محلل تدفق كما هو موضح أعلاه في الخطوات 5.18.1-5.18-5.
Representative Results
تحسين المقايسة المصلية للمراسل الوحيد.
استراتيجية اقتران لجميع المستضدات سارس-CoV-2 موصوفة في كاميرون، وآخرون، 20201 وفي الخطوة 2.1 أعلاه. ويرد وصف لاستراتيجية تأكيد الاقتران في الخطوة 2-3 أعلاه. بالنسبة للاقتران الفعال، يجب أن تكون قيم متوسط كثافة الفلورسينس (MFI) أعلى بكثير من أي تفاعل تحكم سلبي للمصل/لا يوجد أحد مضاد ويجب أن تظهر استجابة جرعة من تقليل إشارة MFI مع تقليل كميات كاشف الكشف. وتشير مؤسسات التمويل الأصغر التي تضم حوالي 000 1 وحدة من وحدات ال MFI أو أكثر على خلفية MFI عموما إلى اقتران البروتين بكفاءة وتعتمد على تركيز وخصوصية كاشف الكشف المستخدم. باستخدام هذه الطريقة، تم اختبار تأكيد اقتران S و RBD و Nc antigen لاثنين من الكثير من الخرز(الشكل 2). وكانت إشارات MFI لجميع المستضدات أعلى بكثير من MFI الخلفية وأظهرت استجابة جرعة مع المعايرة من كاشفات الكشف. وأظهرت البيانات أيضا استنساخ جيدة من مستويات MFI بين اثنين من الكثير من الخرز مقرونة مختلفة.
تم تحسين المقايسة مراسل واحد كما هو موضح في كاميرون، وآخرون، 20201. تم اختبار كل مستضد بتركيزات اقتران مختلفة مع تمييعات مختلفة للعديد من عينات المصل التي تمثل عينات عالية ومتوسطة ومنخفضة وسلبية. بالإضافة إلى ذلك ، لأن المقايسة تقيس ترنح IgG ، تم استخدام مصل IgG المجرد كعينة سلبية إضافية. تظهر نتائج سلسلة تخفيف عينة تمثيلية مع مستويات اقتران مستضد مختلفة في الشكل 3. تم اختبار هذه السلسلة الأولية من التخفيف بتركيز ثابت من كاشفات الكشف للحصول على مجموعة محتملة من مستويات MFI التمثيلية الخاصة بالمضاد والخلفية. ومن هذه البيانات، تم تحديد نطاقات تخفيف عينات إضافية ومستويات اقتران المستضد واختبارها بشكل أكبر مع عينات إضافية (البيانات غير مبينة).
بعد ذلك ، تم تحسين تركيز كاشف الكشف للاستخدام مع تخفيف المصل المختلفة ومستويات اقتران المستضد. تظهر البيانات التمثيلية باستخدام 6 عينات موجبة وعينتين سالبتين في الشكل 4. وبعد إجراء اختبارات إضافية مع عدة مئات من عينات مصل ما قبل COVID-19 السلبية، تم اختيار مستويات اقتران المستضد المثلى النهائية وتركيزات وصي الكشف عن بروتوكول الفحص النهائي، كما هو موضح في القسم 5.
التحويل إلى محايسة تحييد مراسل واحد
تم تحويل المقايسة المصلية لمراسل واحد إلى مقايسة تحييد عن طريق إضافة خطوة حضانة باستخدام ACE2 (ككواشف منافسة) مع الخرز قبل إضافة عينة المصل. من خلال إعادة كمية ACE2 المضافة ، لوحظ تثبيط ربط IgG مستضدات S و RBD ، كما هو موضح في الشكل 5. في حين أن 11 سيرا المريض كان titers مختلفة من IgG، وأظهرت كل انخفاض كبير في إشارة MFI مع زيادة تركيز ACE2. كما هو متوقع، ACE2 يؤثر فقط على إشارات MFI من S و RBD، ولكن ليس مستضد Nc.
تظهر إشارة MFI المتبقية بالنسبة إلى 0 ميكروغرام/مل ACE2 لجميع العينات في الشكل 6. بالنسبة لمعظم العينات، لوحظ فقدان إشارة >30٪ لS وRBD مع زيادة تركيز ACE2. كما هو متوقع، لم يكن هناك أي تأثير ACE2 على إشارة Nc.
التحويل إلى المراسل المزدوج IgG و IgM المقايسة المصلية
بالنسبة للمراسل المزدوج IgG وIgM، تم استخدام شروط فحص المراسل الواحد القياسية لاختبار تركيبات مختلفة من الأجسام المضادة والمراسلين لقنوات المراسلين. قناة RP1 مشابهة لأدوات تحليل التدفق السابقة مع الكشف عن مضان "البرتقالي" للأصباغ مراسل مثل PE. القناة الثانية، RP2، توظف ليزر الإثارة البنفسجية التي يمكن استخدامها للكشف عن "الأزرق" مضان الأصباغ متحمس في 402 نانومتر مع قمم أطياف الانبعاثات في نطاق 421-441 نانومتر.
تم اختبار العديد من تركيبات الأجسام المضادة المختلفة المضادة للإنسان IgG وIgM بتركيزات مختلفة مع تخفيف العينة القياسية 2000 مرة وظروف الحضانة المفصلة في القسم 6. تم إجراء اختبار أولي لصبغة المراسلة DyLight 405 (DL 405؛ الإثارة عند 400 نانومتر والانبعاثات عند 420 نانومتر) لقناة RP2 باستخدام مجموعة من 11 عينة إيجابية PCR مع DFSO تتراوح بين 5 إلى >60 يوما، وعينة مصل تم تجريدها من IgG. لم ينتج كاشف الكشف هذا إشارة عالية في قناة RP2 كما هو موضح في الشكل 7A، B ، C. بالنسبة للعينات ذات النسبة العالية من IgM RP2 MFI ، شوهدت أعلى الإشارات ل RBD و Nc (الشكل 7B، C). في حين ينبغي رفع الثدي IgM في هذا الوقت في بعض العينات، لم تتجاوز مستويات MFI الملاحظة 140 وحدة MFI مع كاشف الكشف IgM. وعلاوة على ذلك، حبة التحكم لIgM تفتقر إلى مجموعة ديناميكية كبيرة لMFI عند استخدام DL 405 اقترانها لمكافحة IgM مقارنة مع PE المسمى المضادة IgM RP1 مراسل المستخدمة في نفس التركيزات(الشكل 7D).
ونظرا لعدم توفر كاشف كشف مناسب يحمل علامة مراسل RP2 ل IgM، فقد تم اختبار البيوتين الأصلي المضاد ل IgG مع SASB لاستخدامه في قناة RP2. لم يكن إشارة لIgG في قناة RP2 مع SASB نفس النطاق الديناميكي كما هو الحال مع SAPE، ولكن كان لا يزال لديها مجموعة مناسبة لقياس الثدي IgG لS، RBD، وNc (الشكل 8). أدت هذه البيانات إلى اختبار مجموعات مختلفة من كاشفات الكشف عن RP1 IgM و RP2 IgG ، كما هو موضح أدناه.
التحويل إلى المقايسة المزدوجة لتحييد المراسل
تم تحويل المقايسة المصلية المراسل المزدوج إلى مقايسة تحييد عن طريق إضافة خطوة حضانة مع ACE2 والخرز ، قبل إضافة عينة المصل. تم استخدام سلسلة تخفيف 2 أضعاف ACE2 بدءا من 16 ميكروغرام / مل ، ثم تم اختبارها مع مجموعات من 11 عينة وجردت سيرا كما هو موضح أعلاه. وبالإضافة إلى ذلك، تم اختبار 3 مجموعات مختلفة من RP1 IgM وRP2 IgG الكشف عن خليط الأجسام المضادة على مجموعة من 11 عينات والضوابط المصل جردت. وترد تفاصيل التركيبات النهائية وتركيزات الكاشفات التي تقرر أنها مثالية في الجدول 1.
للكشف عن IgG ، تم اختبار البيوتين المضاد للإنسان IgG / SASB المستخدم في المقايسة الأصلية لمراسل واحد جنبا إلى جنب مع آخر المضادة IgG المقترنة صبغ مراسل BV. في حين أن BV المصاحبة كان لها إشارات MFI RP2 عالية، شدة إشارة MFI لتيتر IgG تختلف عبر المعايرة ACE2(الشكل 9A،C، E). وكان مزيج البيوتين المضاد للإنسان IgG /SASB انخفاض إشارة MFI أكثر اتساقا عبر المعايرة ACE2 بالمقارنة مع اقتران BV ، مما يدل على استجابة الجرعة ، على الرغم من أن مستويات MFI كانت أقل. تذبذب إشارة من قبل BV المترافقة عبر تركيزات ACE2 تدخلت أيضا مع تحديد تثبيط النسبة المئوية من قبل ACE2 عبر مجموعة من titers IgG مقارنة مع البيوتين المضادة للإنسان IgG / SASB الجمع (الشكل 9B, D , F). العينات ذات إشارات MFI منخفضة، مثل عينة DFSO 3، ليس لديها قياسات عالية بما يكفي لتقييم أداء هذه الكواشف أو قياس قدرة تحييد IgG.
لتحديد titers IgM في قناة RP1، تمت مقارنة PE-مترافقة المضادة IgM إلى IgM المضادة للإنسان اقترانها صبغة مراسل DyLight 549 (DL 549؛ الإثارة في 562 نانومتر والانبعاثات في 576 نانومتر) في التركيزات المدرجة في الجدول 1. من بين هذين الكاشفين، عرض PE anti-IgM مؤسسات MFIs أعلى من تلك التي تم إنشاؤها بواسطة DL 549 Anti-Human IgM للعينات التي تم اختبارها(الشكل 9A، C ، E). كان حبة التحكم IgM قياس إضافة هذه الكواشف مختلفة متوسط مؤسسات التمويل الأصغر من 17،000 ≈ لPE المضادة IgM و 2،723 لDL 549 المصاحبة. وحتى مع هذه الاختلافات، كان تأثير تركيزات ACE2 المختلفة على MFI قابلا للقياس مع اقتران DL 549. لتحديد ACE2 في المئة تثبيط ملزم IgM، كان هناك فرق طفيف ولكن ضئيلة بين اثنين من الكواشف الكشف IgM(الشكل 9B،D، F).
| تركيبه | مراسل | التركيز النهائي في بئر (ميكروغرام / مل) | |
| RP1 | RP2 | ||
| 1 | PE المضادة IgM | 2 | - |
| البيوتين-إيغ | - | 0.62 | |
| ساسب | - | 4 | |
| 2 | DyLight 549 المضادة للإنسان IgM | 1 | - |
| البنفسج الرائعة 421 المضادة للإنسان IgG | - | 1 | |
| 3 | DyLight 549 المضادة للإنسان IgM | 1 | - |
| البيوتين-إيغ | - | 0.62 | |
| ساسب | - | 4 | |
الجدول 1: قائمة من مجموعات صبغ مراسل RP1 وRP2 اختبارها. تم تقييم العديد من الأصباغ مراسل RP1 وRP2 مختلفة لقياس IgG وIgM titers. تم اختبار المجموعات الثلاث الموضحة أعلاه في أوضاع كشف RP1 المختلفة و لتحسين المقايسة تحييد. بالنسبة لتركيبات RP2 باستخدام SASB ، يتم عرض تركيزات للأجسام المضادة للكشف البيوتينية وال SASB. * التركيز النهائي يمثل التركيز النهائي في رد الفعل بشكل جيد.
الشكل 1:مخطط انسيابي يسلط الضوء على خطوات بروتوكول المقايسة الرئيسية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تأكيد اقتران المستضد. واقرن المستضدات في 100، 10 و 1 pmol/106 حبات. بالنسبة لمضادات S و RBD ، تم استخدام أرنب مضاد S سيرا والكشف عنه باستخدام PE Anti-rabbit IgG. لNc، تم استخدام البروتين G-تنقية أرنب متعدد النسيلة المضادة Nc. تظهر منحنيات المعايرة للخرزات إلى جانب 10 pmol S (A) و 100 pmol RBD (B) و 100 pmol Nc (C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحسين تخفيف المصل مع مستويات اقتران مستضد مختلفة. تم اختبار عينات المصل التي تمثل عينات عالية ومتوسطة ومنخفضة وسلبية مع مستضد pmol المختلفة /106 حبة اقترانات. تم اختبار المعايرة المصل 4 أضعاف مع مزيج متعدد من حبات مستضد مقرونة باستخدام بروتوكول المقايسة الموصوفة في القسم 5. يتم عرض قيم MFI لمنحنيات المعايرة ل S (A) و RBD (B) و Nc (C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4:تحديد تخفيف المصل الأمثل وتركيز كاشف الكشف. تم اختبار ثماني عينات مصلية، بما في ذلك المرضى السلبيين (عينتان) ومنخفضة إلى عالية الإيجابية (6 عينات)، في تخفيفات مصل إضافية مع ثلاثة تركيزات كاشف كشف مختلفة. تظهر نتائج MFI ل S (A) ، RBD (B) ، و Nc (C). وبناء على هذه البيانات وغيرها (غير مبينة)، تم اختيار عينة تمييع 1:2000 وتركيز الأجسام المضادة للكشف عن البيوتين من 0.62 ميكروغرام/مل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: الأمثل من واحد مراسل تحييد المقايسة. تم إجراء تعديل المقايسة المصلية لمراسل واحد إلى مقايسة الكشف عن الأجسام المضادة المحايدة عن طريق إضافة خطوة حضانة مع ACE2 كمنافس ، كما هو موضح في القسم 6. تم اختبار مجموعة من 11 عينة ، تتراوح بين titer sera منخفضة إلى عالية الإيجابية ، وعينة مصل مخططة IgG مع سلسلة تمييع مزدوجة من ACE2 تبدأ من 4 ميكروغرام / مل ، باستخدام ظروف الفحص القياسية. عبر هذه المجموعة من تركيزات ACE2 ، يمكن رؤية انخفاض في MFI مع زيادة ACE2 لS (A) و RBD (B) ، ولكن ليس ل Nc (C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تثبيط إشارة في المئة مع ACE2. تظهر نسبة الإشارات المتبقية لمجموعة العينات ال 11 (من الشكل 4). لكل عينة، بغض النظر عن تيتر IgG لها، تم تحقيق انخفاض الحد الأقصى من إشارة MFI ≥30٪ لS (A) و RBD (B) في أعلى تركيز ACE2. بالنسبة لمضاد Nc(C)لم يكن هناك تثبيط كبير للإشارة مع اختبار أي كمية من ACE2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: اختبار DyLight 405 المضادة IgM كما RP2 IgM كاشف الكشف. واستخدمت مجموعة من 11 عينة وسيرا IgG جردت لاختبار DL 405-مترافقة المضادة IgM كمكشف الكشف RP2. تظهر إشارات RP2 IgM MFI ل S (A) ، RBD (B) ، و Nc (C). وكانت أعلى إشارة MFI لأي مستضد مع أي عينة ما يقرب من 140 وحدة MFI لRBD مع العينة H (B). حتى الإشارة على مجموعة حبة التحكم IgM كان أقل من 1000 MFI في قناة RP2 عبر نطاق titer الأجسام المضادة بأكملها ولم تظهر زيادة النطاق الديناميكي لوحظ مع PE المضادة لل IgM الكشف عن الأجسام المضادة في قناة RP1 (D). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: الأمثل من ساسب كمراسل RP2 مع البيوتين المضادة لIgG. واستخدمت مجموعة من 11 عينة وسيرا IgG جردت لاختبار سلسلة تخفيف SASB مع معيار 0.62 ميكروغرام / مل البيوتين المضادة IgG. تظهر مؤسسات التمويل الأصغر التابعة ل IgG الناتجة في قناة RP2 ل S (A) و RBD (B) و Nc (C). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: مقارنة ثلاث مجموعات مختلفة من RP1 IgM وRP1 IgG يمزج الكشف. تم اختبار ثلاثة خلطات مختلفة للأجسام المضادة للكشف على 11 عينة وجردت IgG سيرا. ويرد وصف للتوليفات والتركيزات النهائية المستخدمة في الجدول 1. تم اختبار جميع العينات مع تخفيف ACE2 2 أضعاف، بدءا من 16 ميكروغرام / مل. يتم عرض بيانات العينات في DFSO من 3 و 12 و 30 يوما. تظهر إشارات MFI ل RP1 IgM (برتقالي) وRP2 IgG (أزرق) في A (DFSO 3) وC (DFSO 12) وE (DFSO 30). تظهر مؤسسات التمويل الأصغر المتبقية ACE2 في المائة في B (DFSO 3) و D (DFSO 12) و F (DFSO 30). يتم تمييز الإشارات التي تمثل انخفاضا بنسبة >30٪ مقارنة بعناصر التحكم No ACE2 باللون الأخضر الفاتح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
وسعت هذه الدراسة وظائف متعددة الفلورسنت المجهرية المقايسة ، 3Flex ، أن يقيم نوعيا استجابة IgG للعدوى من قبل سارس - CoV -2 1. في حين أن العديد من المقايسات المصلية ل COVID-19 الكشف عن مستضد واحد، وهذا المقايسة في وقت واحد يقيم S، RBD، وN NC المستضدات، ويتضمن عنصر تحكم الأجسام المضادة الداخلية isotype7. وبالإضافة إلى ذلك، يستخدم ACE2 كمؤشر للكشف عن تحييد الثدي الأجسام المضادة للسارس-CoV-2.
وقد تكون المقايسات المتعددة المستضدات مفيدة بشكل خاص في المستقبل في التمييز بين الاستجابات المناعية بين الأشخاص المصابين والملقحين. مع السارس-CoV-2، إذا تم تقييم الأجسام المضادة S و RBD فقط، سيكون من المستحيل تمييز ما إذا كان هذا يرجع إلى عدوى سابقة أو إلى استجابة الأجسام المضادة للتطعيم. لا يستهدف أي من اللقاحات المستخدمة حاليا مستضد Nc، لذا من خلال تقييم مستضدات S/RBD وNc، من الممكن التمييز بين العدوى الفيروسية السابقة (Nc- و S/RBD-positive) والاستجابة للتطعيم (S/RBD-positive فقط؛ Nc-السلبية).
وفي الدراسة الحالية، نقلت المقايسات المصلية والمحايدة 3Flex (القسمان 5 و6) إلى أداة تحليل تدفق المراسل المزدوج الجديدة (القسمان 7 و8). تشبه بروتوكولات المناعة النموذجية لمقايسات تعدد النماذج المستندة إلى الخرز بروتوكولات ELISA القياسية ، بعد خطوات مماثلة لاحتضان العينات ، واحتضان الأجسام المضادة / المراسلات ، وتحليل النتائج8. وقد أظهرت الدراسات السابقة أيضا كيف يمكن نقل المقايسات ELISA القياسية إلى منصة multixing القائمة على حبة9.
ويمكن نقل بروتوكولات الفحص بسلاسة من أداة المراسلة الواحدة السابقة إلى نظام المراسلين المزدوجين الجديد، كما تبين النتائج التي تم الحصول عليها لعينات الاختبار والضوابط(الشكل 4 والشكل 5). وفي المقايسة المصلية، أظهرت جميع عينات المصل الإيجابية انخفاضا مميزا يستجيب للجرعة في الإشارة المقابلة لتخفيف عينة أعلى وتركيز أقل للأجسام المضادة للكشف، في حين ظلت إشارات العينات السلبية عند مستويات الخلفية. وبالمثل، بالنسبة لمقايسة التحييد، فإن انخفاض الإشارات ل S و RBD، ولكن ليس Nc، يتوافق مع تركيزات متزايدة لمنافس ACE2، في حين أن مصل IgG المجرد كان أقل تأثرا بإضافة ACE2. قبل احتضان الخرز مع ACE2 لمدة 2 دقيقة قبل إضافة عينة المصل (كما هو موضح في القسمين 6 و 8) ، تمت مقارنته أيضا بالجمع بين الخرز مع ACE2 والمصل في نفس الوقت ولم ينتج فرقا كبيرا في النتائج (البيانات غير موضحة). ومع ذلك، لأن النتائج التي تم الحصول عليها مع الخرز بالإضافة إلى ACE2 خطوة ما قبل الحضانة كانت أكثر اتساقا، كان الإجراء النهائي المعتمد لبروتوكول فحص تحييد (القسمين 6 و 8).
ولأن نظام المراسل المزدوج يتضمن قناة مراسل فلورية ثانية، فقد تم تحويل كلا المقايسات إلى مقايسات متساوية الطباعة لقياس استجابات IgG وIgM في نفس الوقت. تسمح وظيفة المراسل المزدوج لم حلل التدفق بجمع إشارات فلورية من كاشفين للكشف عن المراسل لكل تحليل في المضاعف لكل عينة ، مما يضاعف بشكل فعال البيانات التي يتم إنشاؤها لكل عينة في المقايسة. من أجل تطوير وتحسين بروتوكولات الفحص المزدوج للمراسل ، تم تقييم العديد من الأصباغ المراسلة المتاحة تجاريا والأجسام المضادة للكشف عن قناة RP2 الجديدة(الشكل 7 والشكل 8)لتحديد أفضل الخيارات (الخيارات) المتاحة. المضادة IgM الأجسام المضادة المقترنة DL 405 مراسل صبغ لم يكن أداء جيدا في قناة RP2 (الشكل 7)، لذلك biotin المضادة لIgG مع SASB تم تقييمها في وقت لاحق للكشف في قناة RP2 (الشكل 8). تمت مقارنة ثلاث مجموعات من كاشفات الكشف RP1 وRP2 في المقايسة المزدوجة تحييد المراسل(الجدول 1 والشكل 9)لتحديد أفضل المجموعات أداء للكشف المتزامن عن الأجسام المضادة تحييد IgG وIgM. في حين كانت هناك اختلافات كبيرة في كثافة الإشارة بين قناة RP1 باستخدام PE-anti IgM وقناة RP2 باستخدام DL 549 anti-IgM ، لم يكن هناك فرق كبير في قياس تثبيط الربط في المئة من قبل ACE2.
يتم الاعتراف بعدة قيود على الطريقة الحالية وهذه الدراسة. أولا، اقتصرت العينات التي تم اختبارها واستخدامها في تطوير الأسلوب والتحسين على مجموعات من 8-11 عينة. وسيتم اختبار المزيد من العينات في دراسات موسعة للتحقق من أن الطريقة هي الأمثل تماما. ثانيا، تم اختبار عدد محدود من الفلوروفور المراسل وأزواج المراسلين. وسيحدد إجراء مزيد من الاختبارات لجميع المراسلين المتاحين في جميع المجموعات الممكنة الكواشف التي يمكن استخدامها بنجاح في هذه الطريقة. كان الجسم المضاد ل IgG المترافق مع البيوتين مختلفا عن الجسم المضاد ل IgG المترافق مع مراسل BV 421. لذلك ، على الرغم من وجود تباين في كثافة الإشارة ل BV 421 المضادة لIgG ، يمكن أن يكون ذلك بسبب خصوصية الجسم المضاد ولا علاقة له بصبغة المراسل. اختبار الأجسام المضادة الأخرى المتاحة BV 421-اقتران قد تحديد الأجسام المضادة الأخرى التي من شأنها أن تؤدي بشكل جيد في قناة RP2. كما ستقيم الدراسات المستقبلية الجمع بين PE anti-IgM و BV 421 Anti-Human IgG للكشف عنه في RP1 وRP2 على التوالي. وأخيرا، حتى مع القدرة المزدوجة للمراسلة على الآلة، تقتصر المقايسات على نوعين متساويي الأنماط (معلمتان) لكل رد فعل. إذا كان من المقرر قياس أنواع متساوية إضافية أو الرغبة في isotyping الكامل ، فإن ردود الفعل الإضافية باستخدام نفس قناتي المراسل ستحتاج إلى تشغيلها في آبار منفصلة.
تسمح تقنية تعدد المضاعفات المستندة إلى الخرز بتصميم سريع ومرن للاختبارات مع التنفيذ السهل لسير العمل المختبري الروتيني3و4و10. أظهرت هذه الدراسة سهولة نقل المقايسات المصلية والمحايدة 3Flex الموصوفة سابقا ل SARS-CoV-2 إلى نظام تحليل التدفق لقياس IgG بمراسل واحد ، أو مع تعديل طفيف ، وقياس استجابات IgG وIgM في وقت واحد باستخدام اثنين من المراسلين. يتمتع خيار المراسل المزدوج بمزايا واضحة على منصات المراسلين الفردية لأنه يمكن أن يوفر ضعف كمية البيانات لكل عينة ، باستخدام نصف حجم العينة ، وفي نصف عدد آبار التفاعل. مع الأصباغ المراسل المناسب والأجسام المضادة الكشف، يمكن بسهولة تطوير المقايسات isotyping وتنفيذها على أداة تحليل تدفق المراسل المزدوج.
Disclosures
ستيفن أنجيلوني وشيري دنبار هما موظفان في شركة لومينيكس التي تنتج بعض الكواشف والأدوات التي استخدمت في هذه الدراسة. تم رعاية نشر الوصول المفتوح لهذه المقالة من قبل شركة Luminex
Acknowledgments
تم تمويل هذا التقرير من قبل شركة لومينيكس (أوستن، تكساس). يشكر المؤلفون ماثيو سيلفرمان دكتوراه (حلول النشر الطبي الحيوي، ديلراي بيتش، فلوريدا) للمساعدة في التحرير العلمي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACE2 (human) (rec.) | AdipoGen Life Sciences | AG-40B-0192-3050 | |
| Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-065-098 | |
| Bovine Serum Albumin | MilliporeSigma | A7888 | Sigma-Aldrich |
| Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator | Various | ||
| Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 709-675-149 | |
| Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate | Corning | 3650 | |
| Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile | Corning | 6570 | |
| DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5μ fragment specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-475-043 | |
| DyLight 549 AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-506-129 | Discontinued but available from multiple vendors |
| eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate | ThermoFisher Scientific | 62-4317-82 | |
| Fisherbrand Incubating Microplate Shaker | ThermoFisher Scientific | 02-217-757 | Fisher Scientific |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE | ThermoFisher Scientific | P-2771MP | |
| Luminex Magnetic Plate Separator | Luminex Corporation | CN-0269-01 | |
| MagPlex beads | Luminex Corporation | MC100XX-ID | |
| PE AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-116-129 | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | P3813 | Sigma-Aldrich |
| SARS Nucleocapsid Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56683 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
| SARS Nucleocapsid Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56049 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified |
| SARS Spike Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56047 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
| SARS Spike Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56048 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb | SinoBiological | 40150-R007 | |
| Sodium Azide | MilliporeSigma | S2002 | Sigma-Aldrich |
| Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) | ThermoFisher Scientific | S21388 | premium grade |
| Tube Revolver/ Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
| TWEEN 20 | MilliporeSigma | P9416 | Sigma-Aldrich |
| xMAP Antibody Couplng Kit | Luminex Corporation | 40-50016 | |
| xMAP INTELLIFLEX DR-SE | Luminex Corporation | INTELLIFLEX-DRSE-RUO |
References
- Cameron, A., et al. A multiplex microsphere IgG assay for SARS-CoV-2 using ACE2-mediated inhibition as a surrogate for neutralization. Journal of Clinical Microbiology. 59 (2), 02489 (2020).
- Waterboer, T., et al. Multiplex human papillomavirus serology based on in situ-purified glutathione s-transferase fusion proteins. Clinical Chemistry. 51 (10), 1845-1853 (2005).
- Pickering, J. W., et al. A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides. American Journal of Clinical Pathology. 117 (4), 589-596 (2002).
- Ayouba, A., et al. Development of a sensitive and specific serological assay based on Luminex technology for detection of antibodies to Zaire Ebola virus. Journal of Clinical Microbiology. 55 (1), 165-176 (2017).
- Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M. Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. Vastl, J. 116, 1-7 (2017).
- Angeloni, S. Multiplex Bead Mixes Made Easy with an Excel-Based Bead Calculator. , Available from: https://www.luminexcorp.com/blog/mmultiplex-bead-mixes-made-easy-with-an-excel-based-bead-calculator/ (2020).
- EUA Authorized Serology Test Performance. FDA. , Available from: https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eus-authorized-serology-test-performance (2020).
- Indirect ELISA protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/Indirect%20ELISA%20protocol.pdf (2021).
- Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. Journal of Visualized Experiments. (65), e4084 (2012).
- Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 9 (4), 872-876 (2002).
