בסיטו חקר מורין Megakaryopoiesis באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לניתוח אולטרה מבנה של megakaryocytes במקום באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM). מח עצם מורין נאספים, קבועים, מוטבעים בשרף אפוקסי וחתוכים בחלקים אולטרה-דקים. לאחר כתמי ניגודיות, מוח העצם נצפה תחת מיקרוסקופ TEM ב 120 kV.
Abstract
בידול והתבגרות של megakaryocytes להתרחש בשיתוף הדוק עם הרכיבים התאיים והחוץ תאיים של מח העצם. תהליכים אלה מאופיינים בהופעה הדרגתית של מבנים חיוניים בציטופלסמה של מגהקריוציטים כגון גרעין פוליפלואידי ופוליבולוס, רשת ממברנות פנימית הנקראת מערכת קרום תיחום (DMS) וגרגרי אלפא צפופים ואלפא שיימצאו בטסיות דם במחזור. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול סטנדרטי למחקר אולטרה-מבני של מקרונים מורין באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM), המאפשר זיהוי של מאפיינים מרכזיים המגדירים את שלב ההתבגרות שלהם ואת הצפיפות התאית במח העצם. מח העצם הוא סמוק, קבוע, מיובש באתנול, מוטבע שרף פלסטיק, ומותקן ליצירת חתך. חלקים דקים ודקים למחצה מוכנים לתצפיות היסתולוגיות ו- TEM, בהתאמה. שיטה זו יכולה לשמש עבור כל תא מח עצם, בכל מתקן EM ויש לו את היתרון של שימוש בגדלים מדגם קטן המאפשר שילוב של מספר גישות הדמיה על אותו עכבר.
Introduction
Megakaryocytes הם תאים פוליפלואידים גדולים מיוחדים, מקומי במח העצם, אחראי על ייצור טסיות דם1. מקורם בתאי גזע hematopoietic באמצעות תהליך התבגרות מורכב, שבמהלכו מבשרי megakaryocyte גדלים בהדרגה, תוך כדי שינויים מורפולוגיים בו זמנית נרחבים בציטופלסמה ובגרעין2. במהלך ההבשלה, megakaryocytes לפתח מספר אלמנטים מבניים בולטים כולל: גרעין polylobulated, פולשים של קרום פני השטח היוצרים את מערכת קרום התיחום (DMS), אזור היקפי נטול אברונים מוקף רשת cytos שלד מבוסס actin, אברונים רבים כולל α-גרגירים, גרגירים צפופים, ליזוזומים, ומתחמי Golgi מרובים. ברמה האולטרה-מבנית, שינוי משמעותי שנצפה הוא המידור הציטופלסמי לאזורים נפרדים המופרדים על ידי DMS3. אספקה נרחבת זו של ממברנות תדלק את הרחבת התהליכים הציטופלסמיים הארוכים בשלב הראשוני של ייצור טסיות הדם, אשר לאחר מכן לשפץ לתוך טסיות בתוך מחזור הדם. כל פגם במהלך בידול megakaryocyte והתבגרות יכול להשפיע על ייצור טסיות דם במונחים של ספירת טסיות דם ו /או פונקציית טסיות דם.
מיקרוסקופיית אלקטרונים העברת שכבה דקה (TEM) הייתה גישת ההדמיה של בחירה במשך עשרות שנים ומספקת אולטרה-מבנה באיכות גבוהה של מגהקריוציטים שעיצבו את הבנתנו את הפיזיולוגיה של תרומבוזיס4,5. מאמר זה מתמקד בשיטת TEM מתוקננת המאפשרת ללכוד את תהליך ביוגנזה טסיות הדם המתרחשות במקום בתוך microenvironment מח העצם המקומי, אשר יכול לשמש גם כבסיס לנתח כל סוג תא מח עצם. אנו מספקים דוגמאות אולטרה-מבניות להתפתחות של מגהקריוציטים ממבוגרים עד בוגרים לחלוטין, המרחיבים תהליכים ציטופלסמיים לתוך מיקרו-סירקולציה שלסינוסים 6. אנו מתארים גם הליך קל לכימות שלבי ההתבגרות השונים של המגקריוציט, המלמדים על התחדשות ויכולת ייצור טסיות הדם של מח העצם.
Protocol
Representative Results
Discussion
בדיקה ישירה של megakaryocytes בסביבתם הטבעית חיונית כדי להבין megakaryopoiesis היווצרות טסיות דם. בכתב יד זה, אנו מספקים שיטת מיקרוסקופיה אלקטרונית שידור המשלבת שטיפה של מח עצם קיבעון על ידי טבילה, ומאפשר לנתח במקום את המאפיינים המורפולוגיים של כל התהליך של מורפוגנזה מגהקריוציט המתרחש במח העצם.
<…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לפביאן פרומר, ז’אן איב רינקל, דיוויד הופמן, מוניק פרוינד על הסיוע הטכני. עבודה זו נתמכה על ידי ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), האיחוד האירופי באמצעות הקרן האירופית לפיתוח אזורי (ERDF) ועל ידי גרנט ANR-17-CE14-0001-01 ל- H.d.S.
Materials
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
| Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
| Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| Lead citrate – Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
| Mounting medium – Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
| Sodium tetraborate – Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
References
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1). American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).
- Eckly, A., et al. Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. , 1-10 (2020).
- Behnke, O., Forer, A. From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream. European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).
- Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels. Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).
- Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules. Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).
- Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).
- Centurione, L., et al. Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice. Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
