시투에서 전염 전자 현미경 검사를 사용하여 뮤린 메가 카요포이스의 탐사
Summary
여기서, 우리는 투과 전자 현미경 검사법(TEM)을 사용하여 시투에서 거대 카르요세포의 초구조를 분석하는 프로토콜을 제시한다. 뮤린 뼈 졸은 수집, 고정, 에폭시 수지에 내장및 초박형 섹션에서 절단됩니다. 대조 염색 후, 골수는 120 kV에서 TEM 현미경으로 관찰된다.
Abstract
메가카요세포의 분화 및 성숙은 골수의 세포 및 세포 외 구성 요소와 밀접한 관련이 있습니다. 이러한 공정은 폴리플로이드 및 폴리로부트 핵과 같은 거대 카르요세포 세포질에서 필수 구조의 점진적인 출현, 경계막 시스템(DMS) 및 순환 혈소판에서 발견되는 조밀하고 알파 과립이라고 불리는 내부 멤브레인 네트워크인 폴리플로이드 및 폴리로부트 핵과 같은 필수 구조의 점진적인 외관을 특징으로 합니다. 본 기사에서는, 우리는 골수의 성숙 단계와 세포 밀도를 정의하는 주요 특성의 식별을 허용하는 전송 전자 현미경 검사법 (TEM)을 사용하여 뮤린 거대 카르요세포의 시투 초구조 적 연구를위한 표준화 된 프로토콜을 설명합니다. 뼈 로는 플러시, 고정, 에탄올탈수, 플라스틱 수지에 내장, 횡단면을 생성하기 위해 장착된다. 반박형 및 얇은 단면은 각각 조직학 및 TEM 관측을 위해 준비됩니다. 이 방법은 모든 EM 시설에서 모든 골수 세포에 사용할 수 있으며 동일한 마우스에서 여러 이미징 접근법의 조합을 허용하는 작은 샘플 크기를 사용하는 장점이 있습니다.
Introduction
메가카요세포는 골수에 국한되어 혈소판 생산1을담당하는 대형 폴리플로이드 세포를 특수화한다. 그(것)들은 복잡한 성숙 과정을 통해 조혈 줄기 세포에서 유래하고, 그 동안 거대 karyocyte 전구체가 점진적으로 크기가 증가하는 동안, 세포질과 핵2에있는 광대한 수반성 형태 변경을 겪고 있는 동안. 성숙 하는 동안, 메가 karyocytes 포함 하 여 구별 할 수 있는 구조 요소의 수를 개발: 폴리로부이트 핵, 경계 막 시스템을 형성 하는 표면 막의 질 (DMS), 액틴 기반 사이토스켈레탈 네트워크에 의해 둘러싸인 세포기관이 없는 주변 영역, α-과립, 고밀도 과립, 굴절을 포함 하 여 수많은 세포기관. 초구조적 수준에서, 관찰된 주요 수정은 DMS3에의해 분리된 이산 영역으로 세포질 구획화이다. 멤브레인의이 광범위한 공급은 혈소판 생산의 초기 단계에서 긴 세포질 공정의 확장을 연료, 다음 순환 내부 혈소판으로 리모델링됩니다. 메가카요세포 분화 및 성숙 중 모든 결함은 혈소판 수 및/또는 혈소판 기능의 기간 동안 혈소판 생산에 영향을 미칠 수 있습니다.
얇은 층 투과 전자 현미경 검사법 (TEM)은 혈전 포에이시스4,5의생리학에 대한 우리의 이해를 형성 한 거대 카르요세포의 고품질 초구조를 제공하는 수십 년 동안 선택의 이미징 접근 방식이었다. 이 논문은 모든 골수 세포 유형을 분석하는 기초가 될 수 있는 토착 골수 마이크로 환경 내에서 발생하는 혈소판 생물 발생 과정을 포착할 수 있는 표준화된 TEM 방법에 초점을 맞추고 있습니다. 우리는 미숙한 에서 완전히 성숙에 메가 카르요세포의 개발의 초구조적 예를 제공, 이는 시누소이드6의미세 순환으로 세포질 공정을 확장. 우리는 또한 골수의 재생 및 혈소판 생산 능력에 지시, 다른 메가 카요세포 성숙 단계를 정량화하는 쉬운 절차를 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
그들의 토착 환경에서 메가 카요 세포의 직접 검사는 메가 karyopoiesis 및 혈소판 형성을 이해하는 데 필수적이다. 본 원고에서, 우리는 골수 홍조와 침수에 의한 고정을 결합한 투과 전자 현미경 법을 제공하여 골수에서 일어나는 메가 카요세포 형태 발생의 전체 과정의 형태 학적 특성을 시상할 수 있도록 합니다.
골수의 플러싱은 고품질 플러싱의 성공은 작업자의 연습…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 파비엔 프로머, 장 이브 린켈, 데이비드 호프만, 모니크 프룬드에게 기술 지원을 부탁드립니다. 이 작품은 ARMESA (협회 드 Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), 유럽 지역 개발 기금 (ERDF)을 통해 유럽 연합과 그랜트 ANR-17-CE14-0001-01H.d.S.
Materials
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
| Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
| Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| Lead citrate – Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
| Mounting medium – Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
| Sodium tetraborate – Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
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