Hier presenteren we een protocol om de ultrastructuur van de megakaryocyten in situ te analyseren met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Murine beenmerg wordt verzameld, gefixeerd, ingebed in epoxyhars en gesneden in ultradunne secties. Na contrastkleuring wordt het beenmerg waargenomen onder een TEM-microscoop bij 120 kV.
Differentiatie en rijping van megakaryocyten vinden plaats in nauwe associatie met de cellulaire en extracellulaire componenten van het beenmerg. Deze processen worden gekenmerkt door het geleidelijk verschijnen van essentiële structuren in het cytoplasma van megakaryocyten, zoals een polyploïde en polylobulated kern, een intern membraannetwerk genaamd demarcation membrane system (DMS) en de dichte en alfakorrels die zullen worden gevonden in circulerende bloedplaatjes. In dit artikel beschrijven we een gestandaardiseerd protocol voor de in situ ultrastructurele studie van muriene megakaryocyten met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), waardoor de belangrijkste kenmerken kunnen worden geïdentificeerd die hun rijpingsfase en cellulaire dichtheid in het beenmerg bepalen. Beenmerg wordt gespoeld, gefixeerd, gedehydrateerd in ethanol, ingebed in plastic hars en gemonteerd voor het genereren van doorsneden. Halfdunne en dunne secties worden voorbereid op respectievelijk histologische en TEM-waarnemingen. Deze methode kan worden gebruikt voor elke beenmergcel, in elke EM-faciliteit en heeft het voordeel dat kleine steekproefgroottes worden gebruikt die de combinatie van verschillende beeldvormingsbenaderingen op dezelfde muis mogelijk maken.
Megakaryocyten zijn gespecialiseerde grote polyploïde cellen, gelokaliseerd in het beenmerg, verantwoordelijk voor de productie van bloedplaatjes1. Ze zijn afkomstig van hematopoëtische stamcellen door middel van een ingewikkeld rijpingsproces, waarbij megakaryocytvoorlopers geleidelijk in omvang toenemen, terwijl ze uitgebreide gelijktijdige morfologische veranderingen in het cytoplasma en kernondergaan 2. Tijdens de rijping ontwikkelen megakaryocyten een aantal te onderscheiden structurele elementen, waaronder: een polylobulated nucleus, invaginaties van het oppervlaktemembraan die het demarcatiemembraansysteem (DMS) vormen, een perifere zone zonder organellen omringd door het op actine gebaseerde cytoskeletale netwerk, en talrijke organellen waaronder α-korrels, dichte korrels, lysosomen en meerdere Golgi-complexen. Op ultrastructureel niveau is een belangrijke waargenomen wijziging de cytoplasmatische compartimentering in discrete gebieden begrensd door het DMS3. Deze uitgebreide toevoer van membranen zal de uitbreiding van lange cytoplasmatische processen in de beginfase van de bloedplaatjesproductie voeden, die vervolgens in de circulatie zullen worden omgevormd tot bloedplaatjes. Elk defect tijdens megakaryocytendifferentiatie en rijping kan de bloedplaatjesproductie beïnvloeden in termen van het aantal bloedplaatjes en / of de bloedplaatjesfunctie.
Thin layer transmission electron microscopy (TEM) is al tientallen jaren de beeldvormingsbenadering bij uitstek en biedt hoogwaardige ultrastructuur van megakaryocyten die ons begrip van de fysiologie van trombopoiese hebben gevormd4,5. Dit artikel richt zich op een gestandaardiseerde TEM-methode die het mogelijk maakt om het proces van bloedplaatjesbiogenese vast te leggen dat in situ plaatsvindt in de inheemse beenmergmicro-omgeving, die ook als basis kan dienen om elk beenmergceltype te analyseren. We bieden ultrastructurele voorbeelden van de ontwikkeling van megakaryocyten van onvolwassen tot volledig volwassen, die cytoplasmatische processen uitbreiden naar de microcirculatie van sinusoïden6. We beschrijven ook een eenvoudige procedure om de verschillende rijpingsstadia van megakaryocyten te kwantificeren, waarbij we instructies geven over de regeneratie- en bloedplaatjesproductiecapaciteit van het beenmerg.
Direct onderzoek van megakaryocyten in hun oorspronkelijke omgeving is essentieel om megakaryopoiese en bloedplaatjesvorming te begrijpen. In dit manuscript bieden we een transmissie-elektronenmicroscopiemethode die beenmergspoeling en fixatie door onderdompeling combineert, waardoor in situ de morfologische kenmerken van het hele proces van megakaryocytenmorfogenese in het beenmerg kunnen worden ontleed.
Het spoelen van het beenmerg is een cruciale stap van deze methode, omdat het su…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund bedanken voor de technische assistentie. Dit werk werd ondersteund door ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), de Europese Unie via het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (EFRO) en door Subsidie ANR-17-CE14-0001-01 aan H.d.S.
2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
Lead citrate – Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
Mounting medium – Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
Sodium tetraborate – Borax | Sigma, France | B-9876 | |
Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |