यहां, हम ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) का उपयोग करके सीटू में मेगाकारियोसाइट्स की अल्ट्रास्ट्रक्चर का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। मुरीन बोन मैरो एकत्र किए जाते हैं, तय किए जाते हैं, एपॉक्सी राल में एम्बेडेड होते हैं और अल्ट्राथिन वर्गों में कटौती करते हैं। इसके विपरीत धुंधला होने के बाद, बोन मैरो को 120 केवी पर टेम माइक्रोस्कोप के तहत मनाया जाता है।
मेगाकारियोसाइट्स का भेदभाव और परिपक्वता बोन मैरो के सेलुलर और बाह्यकोशिक घटकों के साथ निकट सहयोग में होती है। इन प्रक्रियाओं को मेगाकारियोसाइट साइटोप्लाज्म में आवश्यक संरचनाओं की क्रमिक उपस्थिति जैसे पॉलीप्लाइड और पॉलीलोबुलेटेड न्यूक्लियस, एक आंतरिक झिल्ली नेटवर्क जैसे सीमांकन झिल्ली प्रणाली (डीएमएस) और घने और अल्फा कणिकाओं की विशेषता है जो प्लेटलेट्स परिसंचारी में पाए जाएंगे। इस लेख में, हम ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) का उपयोग करके मुरीन मेगाकारियोसाइट्स के सीटू अल्ट्रास्ट्रक्चरल अध्ययन में एक मानकीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो बोन मैरो में उनके परिपक्वता चरण और सेलुलर घनत्व को परिभाषित करने वाली प्रमुख विशेषताओं की पहचान के लिए अनुमति देता है। बोन मैरो को फ्लश किया जाता है, तय किया जाता है, इथेनॉल में निर्जलित किया जाता है, प्लास्टिक राल में एम्बेडेड होता है, और क्रॉस-सेक्शन पैदा करने के लिए घुड़सवार होता है। अर्ध-पतली और पतले वर्ग क्रमशः हिस्टोलॉजिकल और तेम टिप्पणियों के लिए तैयार किए जाते हैं। इस विधि का उपयोग किसी भी बोन मैरो सेल के लिए किया जा सकता है, किसी भी ईएम सुविधा में और एक ही माउस पर कई इमेजिंग दृष्टिकोणों के संयोजन के लिए अनुमति देने वाले छोटे नमूना आकारों का उपयोग करने का लाभ है।
मेगाकारियोसाइट्स विशेष बड़े पॉलीप्लाइड कोशिकाएं हैं, जो बोन मैरो में स्थानीयकृत हैं, जो प्लेटलेट उत्पादन1के लिए जिम्मेदार हैं। वे एक जटिल परिपक्वता प्रक्रिया के माध्यम से हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न होते हैं, जिसके दौरान मेगाकारियोसाइट अग्रदूत उत्तरोत्तर आकार में वृद्धि करते हैं, जबकि साइटोप्लाज्म और नाभिक 2 में व्यापक सहवर्ती रूपात्मक रूपात्मक परिवर्तनों से गुजरतेहैं। परिपक्वता के दौरान, मेगाकारियोसाइट्स कई विशिष्ट संरचनात्मक तत्वों का विकास करते हैं जिनमें शामिल हैं: एक पॉलीलोब्लुलेटेड न्यूक्लियस, सतह झिल्ली के इन्वेजिनेशन जो सीमांकन झिल्ली प्रणाली (डीएमएस) बनाते हैं, एक परिधीय क्षेत्र जो ऐक्टिन आधारित साइटोस्केलेटल नेटवर्क से घिरे ऑर्गेनेल्स से रहित है, और α-कणिकाओं, घने कणिकाओं, lysosomes, और कई गोलगी परिसरों सहित कई ऑर्गेनेल्स। अल्ट्रास्ट्रक्चरल स्तर पर, एक प्रमुख संशोधन देखा गया है कि डीएमएस3द्वारा सीमित असतत क्षेत्रों में साइटोप्लाज्मिक कंपार्टमेंटाइजेशन है। झिल्ली की यह व्यापक आपूर्ति प्लेटलेट उत्पादन के प्रारंभिक चरण में लंबी साइटोप्लाज्मिक प्रक्रियाओं के विस्तार को बढ़ावा देगी, जो तब परिसंचरण के अंदर प्लेटलेट्स में फिर से तैयार हो जाएगी। मेगाकार्योसाइट भेदभाव और परिपक्वता के दौरान कोई भी दोष प्लेटलेट काउंट और/या प्लेटलेट फंक्शन की अवधि में प्लेटलेट उत्पादन को प्रभावित कर सकता है ।
पतली परत ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) दशकों से पसंद का इमेजिंग दृष्टिकोण रहा है जो मेगाकारियोसाइट्स की उच्च गुणवत्ता वाले अल्ट्रास्ट्रक्चर प्रदान करता है जिसने थ्रोम्बोपोइसिस4,5के शरीर विज्ञान की हमारी समझ को आकार दिया है। यह पेपर एक मानकीकृत टेम विधि पर केंद्रित है जो देशी अस्थि मज्जा माइक्रोएनवायरमेंट के भीतर सीटू में होने वाली प्लेटलेट बायोजेनेसिस की प्रक्रिया को कैप्चर करने की अनुमति देता है, जो किसी भी अस्थि मज्जा कोशिका प्रकार का विश्लेषण करने के लिए एक आधार के रूप में भी काम कर सकता है। हम अपरिपक्व से पूरी तरह परिपक्व तक मेगाकारियोसाइट्स के विकास के अल्ट्रास्ट्रक्चरल उदाहरण प्रदान करते हैं, जो साइनसॉइड6के माइक्रोसर्कुलेशन में साइटोप्लाज्मिक प्रक्रियाओं का विस्तार करते हैं। हम बोन मैरो के पुनर्जनन और प्लेटलेट उत्पादन क्षमता पर निर्देश देते हुए विभिन्न मेगाकार्योसाइट परिपक्वता चरणों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक आसान प्रक्रिया का भी वर्णन करते हैं।
मेगाकारियोपोइसिस और प्लेटलेट बनने को समझने के लिए उनके मूल वातावरण में मेगाकारियोसाइट्स की सीधी जांच जरूरी है। इस पांडुलिपि में, हम विसर्जन द्वारा बोन मैरो फ्लशिंग और निर्धारण के संयोजन के लिए एक ट्?…
The authors have nothing to disclose.
लेखक तकनीकी सहायता के लिए फैबियन प्रोमर, जीन-येव्स रेन्केल, डेविड हॉफमैन, मोनिक फ्रायंड का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को एआरएमईएसए (एसोसिएशन डी रेचेचे एट डेवेलोपमेंट एन मेडेसिन एट सैंटे पब्लिक), यूरोपीय संघ द्वारा यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष (ईआरडीएफ) के माध्यम से और ग्रांट एएनआर-17-सीई14-0001-01 द्वारा H.D.S. को समर्थन दिया गया था ।
2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
Lead citrate – Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
Mounting medium – Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
Sodium tetraborate – Borax | Sigma, France | B-9876 | |
Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |