In situ Exploração de Murine Megacaryopoiesis usando Microscopia eletrônica de transmissão
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para analisar a ultraestrutura dos megacaiócitos in situ usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM). As medulas ósseas murinas são coletadas, fixas, embutidas em resina epóxi e cortadas em seções ultrafinas. Após a coloração de contraste, a medula óssea é observada sob um microscópio TEM a 120 kV.
Abstract
A diferenciação e a maturação dos megacaiócitos ocorrem em estreita associação com os componentes celulares e extracelulares da medula óssea. Esses processos são caracterizados pelo aparecimento gradual de estruturas essenciais no citoplasma de megacaitosto, como um núcleo poliploide e polilobulado, uma rede interna de membrana chamada sistema de membrana demarcação (DMS) e os grânulos densos e alfa que serão encontrados em plaquetas circulantes. Neste artigo, descrevemos um protocolo padronizado para o estudo ultraestrutural in situ de megacariócitos murinas utilizando microscopia eletrônica de transmissão (TEM), permitindo a identificação de características-chave que definem seu estágio de maturação e densidade celular na medula óssea. As medulas ósseas são lavadas, fixas, desidratadas no etanol, embutidas em resina plástica e montadas para geração de seções transversais. Seções semifinas e finas são preparadas para observações histológicas e TEM, respectivamente. Este método pode ser usado para qualquer célula de medula óssea, em qualquer instalação EM e tem a vantagem de usar pequenos tamanhos de amostra permitindo a combinação de várias abordagens de imagem no mesmo mouse.
Introduction
Os megacariócitos são grandes células poliploides especializadas, localizadas na medula óssea, responsáveis pela produção deplaquetas 1. Elas se originam de células-tronco hematopoiéticas através de um intrincado processo de maturação, durante o qual os precursores de megacaitos aumentam progressivamente de tamanho, enquanto passam por extensas alterações morfológicas concomitantes no citoplasma e núcleo2. Durante o amadurecimento, os megacaitos desenvolvem uma série de elementos estruturais distintos, incluindo: um núcleo polilobulado, invaginações da membrana superficial que formam o sistema de membrana de demarcação (DMS), uma zona periférica desprovida de organelas cercadas pela rede citoesqueletal baseada em actina, e inúmeras organelas, incluindo α-granulos, granulos densoss, lysosomes, e múltiplos complexos de Gol. No nível ultraestrutural, uma grande modificação observada é a compartimentação citoplasmática em regiões discretas delimitadas pelo DMS3. Esse extenso fornecimento de membranas alimentará a extensão de longos processos citoplasmados na fase inicial de produção de plaquetas, que depois se remodelará em plaquetas dentro da circulação. Qualquer defeito durante a diferenciação e maturação do megacaito pode afetar a produção de plaquetas em termos de contagem de plaquetas e/ou função plaqueta.
A microscopia eletrônica de transmissão de camada fina (TEM) tem sido a abordagem de imagem escolhida há décadas fornecendo ultraestrutura de alta qualidade de megacaiócitos que moldaram nossa compreensão da fisiologia da trombopoiese4,5. Este artigo se concentra em um método TEM padronizado que permite capturar o processo de biogênese plaquetária que ocorre in situ dentro do microambiente nativo da medula óssea, que também poderia servir de base para analisar qualquer tipo de célula de medula óssea. Fornecemos exemplos ultraestruturais do desenvolvimento de megacaiócitos de imaturos a totalmente maduros, que estendem processos citoplasmicos à microcirculação dos sinusoides6. Descrevemos também um procedimento fácil para quantificar os diferentes estágios de maturação de megacariote, instruindo sobre a capacidade de regeneração e produção de plaquetas da medula óssea.
Protocol
Representative Results
Discussion
O exame direto dos megacaitos em seu ambiente nativo é essencial para entender a megacariopoiese e a formação de plaquetas. Neste manuscrito, fornecemos um método de microscopia eletrônica de transmissão combinando descarga e fixação da medula óssea por imersão, permitindo dissecar in situ as características de morfologia de todo o processo de morfogênese de megacaiócito ocorrendo na medula óssea.
A lavagem da medula óssea é um passo crítico desse método, pois o suce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund pela assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), pela União Europeia através do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (ERDF) e pelo Grant ANR-17-CE14-0001-01 ao H.d.S.
Materials
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
| Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
| Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| Lead citrate – Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
| Mounting medium – Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
| Sodium tetraborate – Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
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