Här presenterar vi ett protokoll för att analysera ultrastructure av megakaryocyterna in situ med hjälp av överföring elektronmikroskopi (TEM). Murin benmärg samlas in, fixas, bäddas in i epoxiharts och skärs i ultrathin sektioner. Efter kontrastfärgning observeras benmärgen under ett TEM-mikroskop vid 120 kV.
Differentiering och mognad av megakaryocyter förekommer i nära samband med cellulära och extracellulära komponenter i benmärgen. Dessa processer kännetecknas av det gradvisa utseendet av väsentliga strukturer i megakaryocytcytplasman såsom en polyploid och polylobulated kärna, ett internt membrannätverk som kallas avgränsning membransystem (DMS) och de täta och alfagranulat som finns i cirkulerande trombocyter. I den här artikeln beskriver vi ett standardiserat protokoll för in situ ultrastructural studie av murine megakaryocyter med hjälp av överföring elektronmikroskopi (TEM), vilket möjliggör identifiering av viktiga egenskaper som definierar deras mognadsstadium och cellulära densitet i benmärgen. Benmärgar spolas, fixeras, dehydreras i etanol, bäddas in i plastharts och monteras för att generera tvärsnitt. Halvtunna och tunna sektioner är förberedda för histologiska respektive TEM observationer. Denna metod kan användas för alla benmärgsceller, i alla EM-anläggningar och har fördelen att använda små provstorlekar som möjliggör kombinationen av flera bildframställningsmetoder på samma mus.
Megakaryocyter är specialiserade stora polyploida celler, lokaliserade i benmärgen, ansvariga för trombocytproduktion1. De härstammar från hematopoetiska stamceller genom en invecklad mognadsprocess, under vilken megakaryocytprekursorer gradvis ökar i storlek, samtidigt som de genomgår omfattande samtidiga morfologiska förändringar i cytoplasman och kärnan2. Under mognad utvecklar megakaryocyter ett antal urskiljbara strukturella element, inklusive: en polylobulerad kärna, invaginationer av ytmembranet som bildar avgränsning membranet (DMS), en perifer zon utan organeller omgiven av det aktinbaserade cytoskeletala nätverket och många organeller inklusive α-granuler, täta granulat, lysosomer och flera Golgi-komplex. På den strukturella nivån är en större modifiering som observeras den cytoplasmiska compartmentalizationen i diskreta regioner avgränsade av DMS3. Denna omfattande tillförsel av membran kommer att driva förlängningen av långa cytoplasmiska processer i den inledande fasen av trombocytproduktionen, som sedan kommer att omvandlas till trombocyter inuti cirkulationen. Eventuella defekter under megakaryocytdifferentiering och mognad kan påverka trombocytproduktionen när det gäller trombocytantal och/eller trombocytfunktion.
Tunt lager transmission elektronmikroskopi (TEM) har varit den bildframställningsmetod som valts i årtionden vilket ger högkvalitativ ultrastruktur av megakaryocyter som har format vår förståelse av fysiologin hos trombopoiesis4,5. Detta dokument fokuserar på en standardiserad TEM-metod som gör det möjligt att fånga processen av trombocyt biogenes som förekommer in situ inom den inhemska benmärg mikromiljön, som också kan tjäna som grund för att analysera någon benmärg cell typ. Vi ger strukturella exempel på utvecklingen av megakaryocyter från omogna till fullt mogna, vilket förlänger cytoplasmiska processer till mikrocirkulationen av sinusoider6. Vi beskriver också ett enkelt förfarande för att kvantifiera de olika megakaryocyt mogna stadierna, instruera om regenerering och trombocyt produktionskapacitet benmärgen.
Direkt undersökning av megakaryocyter i deras ursprungliga miljö är avgörande för att förstå megakaryopoiesis och trombocytbildning. I detta manuskript tillhandahåller vi en överföring elektronmikroskopi metod som kombinerar benmärg spolning och fixering genom nedsänkning, så att dissekera in situ morfologi egenskaper hos hela processen av megakaryocyt morfogenes äger rum i benmärgen.
Spolningen av benmärgen är ett kritiskt steg i denna metod, eftersom framgången fö…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund för tekniskt stöd. Detta arbete stöddes av ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), Europeiska unionen genom Europeiska regionala utvecklingsfonden (ERUF) och genom anslag ANR-17-CE14-0001-01 till H.d.S.
2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
Lead citrate – Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
Mounting medium – Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
Sodium tetraborate – Borax | Sigma, France | B-9876 | |
Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |