تحليل حجم العقدة الليمفاوية بواسطة التصوير بالموجات فوق الصوتية فائقة التردد في نموذج الفأر المصمم وراثيا Braf/Pten لسرطان الجلد
Summary
سرطان الجلد هو مرض عدواني للغاية ينتشر بسرعة إلى الأعضاء الأخرى. يصف هذا البروتوكول تطبيق التصوير بالموجات فوق الصوتية عالية التردد ، إلى جانب تقديم 3D ، لمراقبة حجم الغدد الليمفاوية الإربية في نموذج الفأر Braf / Pten للسرطان الميلانيني النقيلي.
Abstract
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox الفئران المهندسة وراثيا (الفئران Braf/Pten) تستخدم على نطاق واسع كنموذج في الجسم الحي للسرطان الميلانيني النقيلي. بمجرد تحفيز الورم الأولي عن طريق علاج تاموكسيفين ، لوحظت زيادة في العبء النقيلي في غضون 4-6 أسابيع بعد الحث. توضح هذه الورقة كيف يمكن استغلال التصوير بالموجات فوق الصوتية فائقة التردد (UHFUS) لمراقبة الزيادة في المشاركة النقيلية للعقد الليمفاوية الإربية عن طريق قياس الزيادة في حجمها.
يستخدم نظام UHFUS لمسح الفئران المخدرة باستخدام مسبار خطي UHFUS (22-55 ميجاهرتز ، دقة محورية 40 ميكرومتر). يتم الحصول على صور الوضع B من الغدد الليمفاوية الإربية (الجانبين الأيسر والأيمن) في عرض قصير المحور ، مما يضع الحيوانات في حالة استلقاء ظهري. يتم الحصول على سجلات الموجات فوق الصوتية باستخدام حجم خطوة 44 ميكرومتر على ذراع ميكانيكية آلية. بعد ذلك ، يتم استيراد عمليات الاستحواذ ثنائية الأبعاد (2D) B-mode إلى منصة البرامج الخاصة بالمعالجة اللاحقة لصور الموجات فوق الصوتية ، ويتم تحديد الغدد الليمفاوية الإربية وتقسيمها بشكل شبه تلقائي في الصور ثنائية الأبعاد المقطعية المستعرضة المكتسبة. أخيرا ، يتم الحصول على إعادة بناء كاملة لحجم ثلاثي الأبعاد (3D) تلقائيا إلى جانب تقديم حجم العقدة الليمفاوية ، والذي يتم التعبير عنه أيضا كقياس مطلق.
هذه التقنية غير الغازية في الجسم الحي جيدة التحمل للغاية وتسمح بجدولة جلسات تصوير متعددة على نفس التجارب على مدار 2 أسابيع. لذلك ، من المثالي تقييم تأثير العلاج الدوائي على المرض النقيلي.
Introduction
سرطان الجلد هو شكل عدواني من سرطان الجلد الذي ينتشر غالبا إلى مواقع جلدية أخرى (النقائل تحت الجلد)، وكذلك إلى الغدد الليمفاوية والرئتين والكبد والدماغ والعظام1. في العقد الماضي ، تم إدخال أدوية جديدة في الممارسة السريرية وساهمت في تحسين متوسط العمر المتوقع لمرضى سرطان الجلد النقيلي. ومع ذلك، لا تزال هناك قيود، بما في ذلك الوقت المتغير ودرجة الاستجابة، والآثار الجانبية الشديدة، وتمرد المقاومة المكتسبة1. لذلك ، من الأهمية بمكان اكتشاف الانتشار النقيلي في مراحله المبكرة ، أي عندما يصل إلى الغدد الليمفاوية المحلية.
عادة ما يتم إجراء خزعة من الغدد الليمفاوية المحلية (الغدد الليمفاوية الخافرة) للتحقق من وجود خلايا سرطان الجلد. ومع ذلك ، فإن التصوير بالموجات فوق الصوتية يترسخ كطريقة غير جراحية للكشف عن تورط النقيلي ، لأنه يتفوق على التقييم السريري ويمكن أن يساعد في تجنب خزعة غير ضرورية2،3،4. علاوة على ذلك ، يبدو التصوير بالموجات فوق الصوتية مناسبا لمراقبة العقدة الليمفاوية ، خاصة في حالة التقدم في العمر و / أو الأمراض المصاحبة5,6. تشمل الميزات التي يتم اكتشافها عن طريق التحليل بالموجات فوق الصوتية والتي تسمح بالتفريق بين الغدد الليمفاوية الطبيعية والنقيلية زيادة الحجم (الحجم) ، وتغيير الشكل من البيضاوي إلى الدائري ، والهامش غير المنتظم ، وتغيير نمط الصدى ، وتغيير (زيادة) الأوعية الدموية 7.
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox الفئران المهندسة وراثيا (فئران Braf/Pten) تم توفيرها مؤخرا للمجتمع العلمي كنموذج خاص بالأنسجة ومستحث للسرطان الميلانيني النقيلي8. في هذا النموذج الحيواني ، تتطور الأورام الأولية بسرعة كبيرة: تصبح مرئية في غضون 2-3 أسابيع بعد تحريض التحول من النوع البري (wt) Braf إلى BrafV600E وفقدان Pten ، بينما تصل إلى حجم 50-100 مم 3 في غضون 4 أسابيع. في الأسابيع التالية 2 ، يرافق نمو الورم الأساسي زيادة تدريجية في العبء النقيلي في مواقع الجلد الأخرى والغدد الليمفاوية والرئتين.
تم استخدام فئران Braf / Pten على نطاق واسع لأغراض متعددة بما في ذلك تشريح مسارات الإشارات المشاركة في تكوين سرطان الجلد9,10 ، وتحديد خلايا سرطان الجلد من المنشأ11,12,13 ، واختبار خيارات علاجية جديدة من حيث كل من العلاج المستهدف والعلاج المناعي8,14,15,16 . على وجه التحديد ، استخدمنا الفئران Braf / Pten لإثبات أن الليستيريا الأحادية الموهنة (Lmat) تعمل كلقاح مضاد لسرطان الجلد. عندما تدار بشكل منهجي في الإعداد العلاجي ، لا يرتبط Lmat بالسمية الكلية لأنه يتراكم بشكل انتقائي في مواقع الورم. علاوة على ذلك ، فإنه يسبب انخفاضا ملحوظا في كتلة سرطان الجلد الأولي وانخفاضا في العبء النقيلي في الغدد الليمفاوية والرئتين. على المستوى الجزيئي ، يسبب Lmat قتلا استماتيا لخلايا سرطان الجلد ، والذي يرجع ، جزئيا على الأقل ، إلى الأنشطة غير المستقلة للخلايا (التوظيف في الموقع للخلايا الليمفاوية CD4 + و CD8 + T)16.
عندما يتم استخدام الفئران Braf / Pten لنمذجة سرطان الجلد ، يمكن مراقبة نمو الأورام الأولية والنقائل تحت الجلد عن طريق قياسات الفرجار. ومع ذلك ، يجب التحقيق في تورط الغدد الليمفاوية والرئتين باستخدام تقنية بديلة ، ربما تقنية غير غازية تسمح للباحثين بمتابعة نفس الحيوان بمرور الوقت. تصف هذه الورقة استخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية (الشكل 1) ، إلى جانب التحليل الحجمي 3D اللاحق للبيانات التي تم الحصول عليها ، للمراقبة الطولية للزيادة في حجم (حجم) الغدد الليمفاوية الأربية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تشهد البيانات التي تم الحصول عليها في هذه الدراسة على قدرة التصوير بالموجات فوق الصوتية على مراقبة المشاركة النقيلية للعقد الليمفاوية الإربية لنموذج الفأر Braf / Pten للسرطان الميلانيني النقيلي. كما هو موضح سابقا16 ، هذه التقنية مفيدة بشكل خاص لتقييم فعالية العلاج بالعقاقير. هذا …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفان أن يشكرا س. بورشيلي (FTGM، بيزا) على مساعدتها في الإجراءات المتعلقة بالحيوانات. وقد تم دعم هذا العمل من قبل ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica التمويل المؤسسي ل LP ؛ MFAG # 17095 منحت من قبل AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro إلى LP.
Materials
| 4-hydroxytamoxifen | Merck | H6278 | drug used for tumor induction |
| B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice | The Jackson Laboratory | 013590 | |
| Blu gel | Sooft Ialia | ophthalmic solution gel | |
| BRAFV600E antibody | Spring Bioscience Corporation | E19290 | |
| IsoFlo (isoflorane) | Zoetis | liquid for gaseous anaesthesia | |
| MLANA antibody | Thermo Fisher Scientific | M2-7C10 | |
| Sigma gel | Parker | electrode gel | |
| Transonic gel clear | Telic SAU | ultrasound gel | |
| Veet | Reckitt Benckiser IT | depilatory cream | |
| Compact Dual Anesthesia System | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber | |
| MX550S | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS linear probe | |
| Vevo 3100 | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS system | |
| Vevo Imaging Station | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board | |
| Vevo Lab | Fujifilm, Visualsonics Inc. | software platform for ultrasound image post-processing |
References
- Schvartsman, G., et al. Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663 (2019).
- Blum, A., et al. Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma – Results of a prospective study of 1288 patients. Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).
- Olmedo, D., et al. Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis. Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).
- Voit, C., et al. Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma. Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).
- Hayes, A. J., et al. Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma. British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).
- Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients. Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).
- Jayapal, N., et al. Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, 338-346 (2019).
- Dankort, D., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
- Damsky, W. E., et al. β-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas. Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).
- Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma. Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).
- Kohler, C., et al. Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes. Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).
- Yuan, P., et al. Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).
- Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).
- Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma. American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).
- Steinberg, S. M., et al. BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma. Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).
- Vitiello, M., et al. Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma. Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).
- Moon, H., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma. Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).
