흑색종의 Braf/Pten 유전자 조작 마우스 모델에서 초고주파 초음파 이미징에 의한 림프절 부피 분석
Summary
흑색 종은 다른 장기로 빠르게 퍼지는 매우 공격적인 질병입니다. 이 프로토콜은 전이성 흑색종의 Braf/Pten 마우스 모델에서 사타구니 림프절의 부피를 모니터링하기 위해 3D 렌더링과 결합된 초고주파 초음파 이미징의 적용을 설명합니다.
Abstract
Tyr::CreER+, BrafCA/+,Ptenlox/lox 유전자 조작 마우스(Braf/Pten 마우스)는 전이성 흑색종의 생체내 모델로 널리 사용됩니다. 일단 원발성 종양이 타목시펜 처리에 의해 유도되면, 유도 후 4-6 주 이내에 전이성 부담의 증가가 관찰됩니다. 이 논문은 UHFUS(Ultra-High-Frequency UltraSound) 이미징을 활용하여 부피의 증가를 측정하여 사타구니 림프절의 전이성 관여 증가를 모니터링하는 방법을 보여줍니다.
UHFUS 시스템은 UHFUS 선형 프로브 (22-55 MHz, 축 분해능 40 μm)로 마취 된 마우스를 스캔하는 데 사용됩니다. 사타구니 림프절 (왼쪽과 오른쪽 모두)의 B 모드 이미지는 짧은 축보기로 수집되어 동물을 등쪽 난해부에 배치합니다. 초음파 기록은 전동 기계식 암에 44 μm 스텝 크기를 사용하여 수집됩니다. 그 후, 2차원(2D) B 모드 획득은 초음파 이미지 후처리를 위한 소프트웨어 플랫폼으로 가져오고, 획득한 횡단면 2D 이미지에서 사타구니 림프절을 반자동으로 식별하고 분할합니다. 마지막으로, 3차원(3D) 부피의 전체 재구성은 림프절 부피의 렌더링과 함께 자동으로 얻어지며, 이는 또한 절대 측정으로 표현된다.
이러한 비침습적 생체내 기술은 매우 잘 견디며, 2주에 걸쳐 동일한 실험 동물에 대한 다수의 이미징 세션의 스케줄링을 허용한다. 따라서 약리학 적 치료가 전이성 질환에 미치는 영향을 평가하는 것이 이상적입니다.
Introduction
흑색종은 종종 다른 피부 부위 (피하 전이)뿐만 아니라 림프절, 폐, 간, 뇌 및 뼈로 퍼지는 공격적인 형태의 피부암입니다1. 지난 십 년 동안 신약이 임상 실습에 도입되었으며 전이성 흑색종 환자의 기대 수명을 향상시키는 데 기여했습니다. 그러나 반응의 가변적 인 시간과 정도, 심각한 부작용 및 후천적 인 저항의 반란을 포함하여 한계가 남아 있습니다1. 따라서 초기 단계, 즉 국소 림프절에 도달 할 때 전이성 확산을 감지하는 것이 중요합니다.
국소 림프절 (센티넬 림프절)의 생검은 일반적으로 흑색종 세포의 존재를 확인하기 위해 수행됩니다. 그러나 초음파 영상은 임상 평가를 능가하고 불필요한 생검을 피하는 데 도움이 될 수 있기 때문에 전이성 개입을 탐지하는 비 침습적 방법으로 자리 잡고 있습니다2,3,4. 또한, 초음파 영상은 림프절 감시, 특히 고령 및/또는 합병증의 경우5,6에 적합한 것으로 보인다. 초음파 분석에 의해 검출되고 정상 림프절과 전이성 림프절 사이의 분화를 허용하는 특징은 크기 (부피) 증가, 타원형에서 둥글게의 모양 변화, 불규칙한 여백, 변경된 echogenic 패턴 및 변경된 (증가된) 혈관화7를 포함한다.
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox 유전자 조작 마우스(Braf/Pten 마우스)는 최근 전이성 흑색종에 대한 조직 특이적이고 유도성 모델로서 과학계에 제공되었다8. 이 동물 모델에서 원발성 종양은 매우 빠르게 발달합니다 : 야생형 (wt) Braf에서 BrafV600E로의 전환 유도 후 2-3 주 이내에 볼 수 있으며 Pten의 손실은 4 주 이내에 50-100mm3의 부피에 도달합니다. 다음 2 주 동안, 원발성 종양의 성장은 다른 피부 부위, 림프절 및 폐에서 전이성 부담의 점진적 증가를 동반한다.
Braf/Pten 마우스는 흑색종 발생9,10에 관여하는 신호전달 경로의 해부, 기원의 흑색종 세포의 확인11,12,13, 표적 요법과 면역요법 모두에서 새로운 치료 옵션의 시험을 포함하여 여러 목적으로 광범위하게 사용되어 왔습니다.8,14,15,16 . 특히, 우리는 Braf / Pten 마우스를 사용하여 약독화 된 리스테리아 단세포 유전자 (Lmat)가 항 흑색종 백신으로 작용한다는 것을 입증했습니다. 치료 환경에서 전신적으로 투여될 때, Lmat은 종양 부위에 선택적으로 축적되기 때문에 전반적인 독성과 관련되지 않는다. 또한, 원발성 흑색종 질량의 현저한 감소와 림프절과 폐의 전이성 부담의 감소를 일으킨다. 분자 수준에서, Lmat은 흑색종 세포의 사멸을 일으키는데, 이는 적어도 부분적으로는 비세포-자율적 활동(CD4+ 및 CD8+ T 림프구의 현장 모집)16에 기인한다.
Braf/Pten 마우스가 흑색종 모델링에 사용될 때, 원발성 종양 및 피하 전이의 성장은 캘리퍼 측정에 의해 모니터링될 수 있다. 그러나 림프절과 폐의 개입은 대체 기술을 사용하여 조사해야하며, 연구자가 시간이 지남에 따라 동일한 동물을 따라갈 수있게 해주는 비 침습적 일 수 있습니다. 이 논문은 사타구니 림프절의 크기 (부피) 증가의 종방향 모니터링을 위해 획득 된 데이터의 후속 3D 체적 분석과 결합 된 초음파 이미징 (그림 1)의 사용을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구에서 얻은 데이터는 전이성 흑색종의 Braf / Pten 마우스 모델의 사타구니 림프절의 전이성 관여를 모니터링하는 초음파 이미징의 능력을 증명합니다. 앞서 보여진 바와 같이16, 이 기술은 약물 치료의 효능을 평가하는데 특히 유용하다. 이는 t1 andt2 에서 수집된 측정치와 t0에서 수집된 측정값을 비교함으로써 시간에 따른 동일한 동물에서 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 동물 절차에 대한 그녀의 도움에 대해 S. Burchielli (FTGM, Pisa)에게 감사하고 싶습니다. 이 작업은 ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica 기관 자금 조달에 의해 LP에 지원되었습니다. MFAG #17095는 AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro가 LP에 수여했습니다.
Materials
| 4-hydroxytamoxifen | Merck | H6278 | drug used for tumor induction |
| B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice | The Jackson Laboratory | 013590 | |
| Blu gel | Sooft Ialia | ophthalmic solution gel | |
| BRAFV600E antibody | Spring Bioscience Corporation | E19290 | |
| IsoFlo (isoflorane) | Zoetis | liquid for gaseous anaesthesia | |
| MLANA antibody | Thermo Fisher Scientific | M2-7C10 | |
| Sigma gel | Parker | electrode gel | |
| Transonic gel clear | Telic SAU | ultrasound gel | |
| Veet | Reckitt Benckiser IT | depilatory cream | |
| Compact Dual Anesthesia System | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber | |
| MX550S | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS linear probe | |
| Vevo 3100 | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS system | |
| Vevo Imaging Station | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board | |
| Vevo Lab | Fujifilm, Visualsonics Inc. | software platform for ultrasound image post-processing |
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