Analyse du volume des ganglions lymphatiques par imagerie ultrasonore à ultra-haute fréquence dans le modèle murin de mélanome génétiquement modifié Braf/Pten
Summary
Le mélanome est une maladie très agressive qui se propage rapidement à d’autres organes. Ce protocole décrit l’application de l’imagerie échographique à ultra-haute fréquence, associée à un rendu 3D, pour surveiller le volume des ganglions lymphatiques inguinaux dans le modèle murin Braf/Pten du mélanome métastatique.
Abstract
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox les souris génétiquement modifiées (souris Braf/Pten) sont largement utilisées comme modèle in vivo de mélanome métastatique. Une fois qu’une tumeur primaire a été induite par un traitement au tamoxifène, une augmentation de la charge métastatique est observée dans les 4 à 6 semaines suivant l’induction. Cet article montre comment l’imagerie ultra-haute fréquence ultra-haute fréquence (UHFUS) peut être exploitée pour surveiller l’augmentation de l’implication métastatique des ganglions lymphatiques inguinaux en mesurant l’augmentation de leur volume.
Le système UHFUS est utilisé pour scanner des souris anesthésiées avec une sonde linéaire UHFUS (22-55 MHz, résolution axiale 40 μm). Les images en mode B des ganglions lymphatiques inguinaux (côtés gauche et droit) sont acquises dans une vue à axe court, positionnant les animaux en position couchée dorsale. Les enregistrements d’échographie sont acquis en utilisant une taille de pas de 44 μm sur un bras mécanique motorisé. Ensuite, les acquisitions bidimensionnelles (2D) en mode B sont importées dans la plate-forme logicielle pour le post-traitement de l’image échographique, et les ganglions lymphatiques inguinaux sont identifiés et segmentés semi-automatiquement dans les images 2D transversales acquises. Enfin, une reconstruction totale du volume tridimensionnel (3D) est automatiquement obtenue avec le rendu du volume des ganglions lymphatiques, qui est également exprimé sous forme de mesure absolue.
Cette technique in vivo non invasive est très bien tolérée et permet de programmer plusieurs séances d’imagerie sur un même animal expérimental sur 2 semaines. Il est donc idéal d’évaluer l’impact du traitement pharmacologique sur la maladie métastatique.
Introduction
Le mélanome est une forme agressive de cancer de la peau qui se propage souvent à d’autres sites cutanés (métastases sous-cutanées), ainsi qu’aux ganglions lymphatiques, aux poumons, au foie, au cerveau et aux os1. Au cours de la dernière décennie, de nouveaux médicaments ont été introduits dans la pratique clinique et ont contribué à améliorer l’espérance de vie des patients atteints de mélanome métastatique. Cependant, des limites subsistent, notamment un temps et un degré de réponse variables, des effets secondaires graves et l’insurrection de la résistance acquise1. Par conséquent, il est crucial de détecter la propagation métastatique à ses premiers stades, c’est-à-dire lorsqu’elle atteint les ganglions lymphatiques locaux.
Une biopsie des ganglions lymphatiques locaux (ganglions sentinelles) est habituellement effectuée pour vérifier la présence de cellules de mélanome. Cependant, l’imagerie échographique s’impose comme une méthode non invasive de détection de l’atteinte métastatique, car elle surpasse l’évaluation clinique et peut aider à éviter une biopsie inutile2,3,4. De plus, l’échographie semble appropriée pour la surveillance des ganglions lymphatiques, en particulier dans le cas d’un âge avancé et/ou de comorbidités5,6. Les caractéristiques détectées par échographie et permettant la différenciation entre les ganglions lymphatiques normaux et métastatiques comprennent une augmentation de la taille (volume), un changement de forme de l’ovale au rond, une marge irrégulière, un schéma échogénique altéré et une vascularisation altérée (accrue)7.
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox des souris génétiquement modifiées (souris Braf/Pten) ont récemment été mises à la disposition de la communauté scientifique en tant que modèle tissulaire spécifique et inductible pour le mélanome métastatique8. Dans ce modèle animal, les tumeurs primaires se développent très rapidement: elles deviennent visibles dans les 2-3 semaines suivant l’induction du passage de la braf de type sauvage (wt) à BrafV600E et de la perte de Pten, alors qu’elles atteignent un volume de 50-100 mm3 en 4 semaines. Dans les 2 semaines suivantes, la croissance de la tumeur primaire s’accompagne d’une augmentation progressive de la charge métastatique dans d’autres sites cutanés, ganglions lymphatiques et poumons.
Les souris Braf/Pten ont été largement utilisées à de multiples fins, notamment la dissection des voies de signalisation impliquées dans la mélanome9,10, l’identification des cellules de mélanome d’origine11,12,13 et le test de nouvelles options thérapeutiques en termes de traitement ciblé et d’immunothérapie8,14,15,16 . Plus précisément, nous avons utilisé des souris Braf/Pten pour démontrer que Listeria monocytogenes atténuée (Lmat) fonctionne comme un vaccin anti-mélanome. Lorsqu’il est administré par voie systémique dans le cadre thérapeutique, Lmat n’est pas associé à une toxicité globale car il s’accumule sélectivement sur les sites tumoraux. En outre, il provoque une diminution remarquable de la masse du mélanome primaire et une réduction de la charge métastatique dans les ganglions lymphatiques et les poumons. Au niveau moléculaire, Lmat provoque la destruction apoptotique des cellules de mélanome, qui est due, au moins en partie, à des activités non autonomes cellulaires (recrutement sur place de lymphocytes T CD4+ et CD8+)16.
Lorsque des souris Braf /Pten sont utilisées pour la modélisation du mélanome, la croissance des tumeurs primaires et des métastases sous-cutanées peut être surveillée par des mesures d’étrier. Cependant, l’implication des ganglions lymphatiques et des poumons doit être étudiée à l’aide d’une technique alternative, peut-être non invasive qui permet aux chercheurs de suivre le même animal au fil du temps. Cet article décrit l’utilisation de l’imagerie échographique (Figure 1), associée à une analyse volumétrique 3D ultérieure des données obtenues, pour la surveillance longitudinale de l’augmentation de la taille (volume) des ganglions lymphatiques inguinaux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les données obtenues dans cette étude attestent de la capacité de l’imagerie échographique à surveiller l’implication métastatique des ganglions lymphatiques inguinaux du modèle murin Braf/Pten du mélanome métastatique. Comme indiqué précédemment16, cette technique est particulièrement utile pour évaluer l’efficacité du traitement médicamenteux. En effet, il permet de surveiller l’évolution du volume des ganglions lymphatiques chez le même animal au fil du temps, en compa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier S. Burchielli (FTGM, Pise) pour son aide dans les procédures animales. Ce travail a été soutenu par ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica financement institutionnel à LP; MFAG #17095 décerné par AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro à LP.
Materials
| 4-hydroxytamoxifen | Merck | H6278 | drug used for tumor induction |
| B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice | The Jackson Laboratory | 013590 | |
| Blu gel | Sooft Ialia | ophthalmic solution gel | |
| BRAFV600E antibody | Spring Bioscience Corporation | E19290 | |
| IsoFlo (isoflorane) | Zoetis | liquid for gaseous anaesthesia | |
| MLANA antibody | Thermo Fisher Scientific | M2-7C10 | |
| Sigma gel | Parker | electrode gel | |
| Transonic gel clear | Telic SAU | ultrasound gel | |
| Veet | Reckitt Benckiser IT | depilatory cream | |
| Compact Dual Anesthesia System | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber | |
| MX550S | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS linear probe | |
| Vevo 3100 | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS system | |
| Vevo Imaging Station | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board | |
| Vevo Lab | Fujifilm, Visualsonics Inc. | software platform for ultrasound image post-processing |
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