Анализ объема лимфатических узлов с помощью ультравысокочастотной ультразвуковой визуализации в генно-инженерной мышиной модели меланомы Braf/Pten
Summary
Меланома – очень агрессивное заболевание, которое быстро распространяется на другие органы. Этот протокол описывает применение ультравысокочастотной ультразвуковой визуализации в сочетании с 3D-рендерингом для мониторинга объема паховых лимфатических узлов в мышиной модели метастатической меланомы Брафа / Птена.
Abstract
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox генетически модифицированные мыши (мыши Braf/Pten) широко используются в качестве модели in vivo метастатической меланомы. После того, как первичная опухоль была индуцирована лечением тамоксифеном, увеличение метастатической нагрузки наблюдается в течение 4-6 недель после индукции. В этой статье показано, как ультравысокочастотная ультразвуковая (UHFUS) визуализация может быть использована для мониторинга увеличения метастатического поражения паховых лимфатических узлов путем измерения увеличения их объема.
Система UHFUS используется для сканирования обезболенных мышей с помощью линейного зонда UHFUS (22-55 МГц, осевое разрешение 40 мкм). Изображения B-режима из паховых лимфатических узлов (как с левой, так и с правой стороны) получаются в виде с короткой осью, позиционируя животных в дорсальной лежачем положении. Ультразвуковые записи приобретаются с использованием шага размером 44 мкм на моторизованной механической руке. После этого двухмерные (2D) B-режимы импортируются в программную платформу для постобработки ультразвуковых изображений, а паховые лимфатические узлы идентифицируются и сегментируются полуавтоматически в полученных поперечных 2D-изображениях. Наконец, автоматически получается полная реконструкция трехмерного (3D) объема вместе с визуализацией объема лимфатического узла, что также выражается в виде абсолютного измерения.
Этот неинвазивный метод in vivo очень хорошо переносится и позволяет планировать несколько сеансов визуализации на одном и том же экспериментальном животном в течение 2 недель. Поэтому идеально оценивать влияние фармакологического лечения на метастатическое заболевание.
Introduction
Меланома является агрессивной формой рака кожи, которая часто распространяется на другие участки кожи (подкожные метастазы), а также на лимфатические узлы, легкие, печень, мозг и кости1. В последнее десятилетие в клиническую практику были введены новые препараты, которые способствовали улучшению продолжительности жизни пациентов с метастатической меланомой. Тем не менее, ограничения остаются, включая переменное время и степень реакции, серьезные побочные эффекты и рост приобретенной резистентности1. Поэтому крайне важно обнаружить метастатическое распространение на ранних стадиях, т. е. когда оно попадает в местные лимфатические узлы.
Биопсия местных лимфатических узлов (сторожевых лимфатических узлов) обычно проводится для проверки наличия клеток меланомы. Тем не менее, ультразвуковая визуализация закрепляется как неинвазивный метод обнаружения метастатического поражения, поскольку она превосходит клиническую оценку и может помочь избежать ненужной биопсии2,3,4. Кроме того, ультразвуковая визуализация представляется подходящей для наблюдения за лимфатическими узлами, особенно в случае пожилого возраста и / или сопутствующих заболеваний5,6. Признаки, которые выявляются ультразвуковым анализом и позволяют дифференцировать нормальные и метастатические лимфатические узлы, включают увеличение размера (объема), изменение формы от овала до круглого, неправильное краевое, измененный эхогенный рисунок и измененную (повышенную) васкуляризацию7.
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox генетически модифицированные мыши (мыши Braf/Pten) недавно стали доступны научному сообществу в качестве тканеспецифической и индуцируемой модели метастатической меланомы8. В этой животной модели первичные опухоли развиваются очень быстро: они становятся видимыми в течение 2-3 недель после индукции перехода с брафа дикого типа (wt) на BrafV600E и потери Pten, при этом они достигают объема 50-100 мм3 в течение 4 недель. В последующие 2 недели рост первичной опухоли сопровождается прогрессирующим увеличением метастатической нагрузки на другие участки кожи, лимфатические узлы, легкие.
Мыши Braf/Pten широко использовались для различных целей, включая рассечение сигнальных путей, участвующих в меланомагенезе9,10, идентификацию клеток меланомы происхождения11,12,13 и тестирование новых терапевтических вариантов с точки зрения как таргетной терапии, так и иммунотерапии8,14,15,16 . В частности, мы использовали мышей Braf / Pten, чтобы продемонстрировать, что ослабленный Listeria monocytogenes (Lmat) работает как вакцина против меланомы. При систематическом введении в терапевтических условиях Lmat не связан с общей токсичностью, поскольку он избирательно накапливается в опухолевых участках. Кроме того, это вызывает заметное снижение массы первичной меланомы и снижение метастатической нагрузки в лимфатических узлах и легких. На молекулярном уровне Lmat вызывает апоптотическое уничтожение клеток меланомы, что обусловлено, по крайней мере частично, неэлементно-автономной деятельностью (рекрутирование на месте CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов)16.
Когда мыши Braf / Pten используются для моделирования меланомы, рост первичных опухолей и подкожных метастазов может контролироваться с помощью измерений суппорта. Тем не менее, вовлечение лимфатических узлов и легких должно быть исследовано с использованием альтернативной техники, возможно, неинвазивной, которая позволяет исследователям следить за одним и тем же животным с течением времени. В данной работе описано использование ультразвуковой визуализации (рисунок 1) в сочетании с последующим 3D объемным анализом полученных данных, для продольного мониторинга увеличения размеров (объема) паховых лимфатических узлов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Данные, полученные в этом исследовании, свидетельствуют о способности ультразвуковой визуализации контролировать метастатическое вовлечение паховых лимфатических узлов мышиной модели метастатической меланомы Брафа/Птена. Как показано ранее16, данная методика особенно …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить С. Буркьелли (FTGM, Пиза) за ее помощь в процедурах для животных. Эта работа была поддержана ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica институциональное финансирование LP; MFAG #17095 присужден AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro LP.
Materials
| 4-hydroxytamoxifen | Merck | H6278 | drug used for tumor induction |
| B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice | The Jackson Laboratory | 013590 | |
| Blu gel | Sooft Ialia | ophthalmic solution gel | |
| BRAFV600E antibody | Spring Bioscience Corporation | E19290 | |
| IsoFlo (isoflorane) | Zoetis | liquid for gaseous anaesthesia | |
| MLANA antibody | Thermo Fisher Scientific | M2-7C10 | |
| Sigma gel | Parker | electrode gel | |
| Transonic gel clear | Telic SAU | ultrasound gel | |
| Veet | Reckitt Benckiser IT | depilatory cream | |
| Compact Dual Anesthesia System | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber | |
| MX550S | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS linear probe | |
| Vevo 3100 | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS system | |
| Vevo Imaging Station | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board | |
| Vevo Lab | Fujifilm, Visualsonics Inc. | software platform for ultrasound image post-processing |
References
- Schvartsman, G., et al. Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663 (2019).
- Blum, A., et al. Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma – Results of a prospective study of 1288 patients. Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).
- Olmedo, D., et al. Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis. Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).
- Voit, C., et al. Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma. Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).
- Hayes, A. J., et al. Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma. British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).
- Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients. Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).
- Jayapal, N., et al. Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, 338-346 (2019).
- Dankort, D., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
- Damsky, W. E., et al. β-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas. Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).
- Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma. Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).
- Kohler, C., et al. Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes. Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).
- Yuan, P., et al. Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).
- Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).
- Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma. American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).
- Steinberg, S. M., et al. BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma. Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).
- Vitiello, M., et al. Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma. Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).
- Moon, H., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma. Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).
