Braf/Pten Genetiği Mühendisliğiyle Tasarlanmış Melanom Fare Modelinde Ultra Yüksek Frekanslı Ultrason Görüntüleme ile Lenf Düğümü Hacminin Analizi
Summary
Melanom, hızla diğer organlara yayılan çok agresif bir hastalıktır. Bu protokol, metastatik melanomun Braf / Pten fare modelindeki inguinal lenf düğümlerinin hacmini izlemek için 3D render ile birlikte ultra yüksek frekanslı ultrason görüntülemenin uygulanmasını açıklamaktadır.
Abstract
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox genetiği değiştirilmiş fareler (Braf/Pten fareleri), metastatik melanomun in vivo modeli olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Tamoksifen tedavisi ile primer tümör indüklendikten sonra, indüksiyondan sonraki 4-6 hafta içinde metastatik yükte bir artış gözlenir. Bu yazıda, inguinal lenf nodlarının metastatik tutulumundaki artışı, hacimlerindeki artışı ölçerek izlemek için Ultra-Yüksek Frekanslı UltraSound (UHFUS) görüntülemenin nasıl kullanılabileceği gösterilmektedir.
UHFUS sistemi, anestezi uygulanmış fareleri UHFUS lineer prob (22-55 MHz, eksenel çözünürlük 40 μm) ile taramak için kullanılır. Kasık lenf düğümlerinden (hem sol hem de sağ taraftan) B modu görüntüleri, hayvanları dorsal yassılığa yerleştirerek kısa eksenli bir görünümde elde edilir. Ultrason kayıtları, motorlu bir mekanik kol üzerinde 44 μm adım boyutu kullanılarak elde edilir. Daha sonra, iki boyutlu (2D) B-mod alımları, ultrason görüntüsü sonrası işlem için yazılım platformuna aktarılır ve elde edilen kesitsel 2D görüntülerde inguinal lenf düğümleri yarı otomatik olarak tanımlanır ve bölümlere ayrılır. Son olarak, üç boyutlu (3D) hacmin toplam rekonstrüksiyonu, mutlak bir ölçüm olarak da ifade edilen lenf nodu hacminin oluşturulması ile birlikte otomatik olarak elde edilir.
Bu non-invaziv in vivo teknik çok iyi tolere edilir ve 2 hafta boyunca aynı deney hayvanı üzerinde çoklu görüntüleme seanslarının planlanmasına izin verir. Bu nedenle, farmakolojik tedavinin metastatik hastalık üzerindeki etkisini değerlendirmek idealdir.
Introduction
Melanom, sıklıkla diğer cilt bölgelerine (deri altı metastazları) ve ayrıca lenf düğümlerine, akciğerlere, karaciğere, beyne ve kemiklere yayılan agresif bir cilt kanseri şeklidir1. Son on yılda, yeni ilaçlar klinik uygulamaya girmiş ve metastatik melanom hastalarının yaşam beklentisinin iyileştirilmesine katkıda bulunmuştur. Bununla birlikte, değişken yanıt süresi ve derecesi, ciddi yan etkiler ve edinilmiş direncin isyanı dahil olmak üzere sınırlamalar devam etmektedir1. Bu nedenle, metastatik yayılımı erken aşamalarında, yani lokal lenf düğümlerine ulaştığında tespit etmek çok önemlidir.
Lokal lenf düğümlerinin (sentinel lenf düğümleri) biyopsisi genellikle melanom hücrelerinin varlığını kontrol etmek için yapılır. Bununla birlikte, ultrason görüntüleme, klinik değerlendirmeden daha iyi performans gösterdiği ve gereksiz bir biyopsiden kaçınmaya yardımcı olabileceği için metastatik tutulumu tespit etmek için invaziv olmayan bir yöntem olarak kabul edilmektedir2,3,4. Ayrıca, ultrason görüntüleme, özellikle ileri yaş ve/veya komorbiditelerde5,6 lenf nodu sürveyansı için uygun görünmektedir. Ultrason analizi ile saptanan ve normal ve metastatik lenf nodları arasındaki farklılaşmaya izin veren özellikler, artan boyut (hacim), ovalden yuvarlaka şekil değişikliği, düzensiz marj, değişmiş ekojenik patern ve değişmiş (artmış) vaskülarizasyondan oluşur7.
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox genetiği değiştirilmiş fareler (Braf/Pten fareleri) yakın zamanda metastatik melanom için dokuya özgü ve indüklenebilir bir model olarak bilimsel topluluğa sunulmuştur8. Bu hayvan modelinde, primer tümörler çok hızlı bir şekilde gelişir: vahşi tip (wt) Braf’tan BrafV600E’ye geçişin ve Pten kaybının indüklenmesinden sonraki 2-3 hafta içinde görünür hale gelirlerken, 4 hafta içinde 50-100 mm3’lük bir hacme ulaşırlar. Takip eden 2 hafta içinde, primer tümörün büyümesine, diğer cilt bölgelerinde, lenf düğümlerinde ve akciğerlerde metastatik yükte ilerleyici bir artış eşlik eder.
Braf/Pten fareleri, melanomagenezde rol oynayan sinyal yolaklarının diseksiyonu9,10, menşe melanom hücrelerinin tanımlanması11,12,13 ve hem hedefe yönelik tedavi hem de immünoterapi açısından yeni terapötik seçeneklerin test edilmesi dahil olmak üzere birçok amaç için yaygın olarak kullanılmaktadır8,14,15,16 . Spesifik olarak, zayıflatılmış Listeria monocytogenes’in (Lmat) bir anti-melanom aşısı olarak çalıştığını göstermek için Braf / Pten farelerini kullandık. Terapötik ortamda sistemik olarak uygulandığında, Lmat, tümör bölgelerinde seçici olarak biriktiği için genel toksisite ile ilişkili değildir. Ayrıca, primer melanom kütlesinde belirgin bir azalmaya ve lenf nodlarında ve akciğerlerde metastatik yükte bir azalmaya neden olur. Moleküler düzeyde, Lmat, melanom hücrelerinin apoptotik olarak öldürülmesine neden olur, bu da en azından kısmen, hücre otonom olmayan aktivitelere (CD4 + ve CD8 + T lenfositlerinin yerinde işe alınması) bağlıdır16.
Melanom modellemesi için Braf/Pten fareleri kullanıldığında, primer tümörlerin ve deri altı metastazlarının büyümesi kumpas ölçümleri ile izlenebilir. Bununla birlikte, lenf düğümlerinin ve akciğerlerin tutulumu, araştırmacıların zaman içinde aynı hayvanı takip etmelerini sağlayan alternatif bir teknik, muhtemelen invaziv olmayan bir teknik kullanılarak araştırılmalıdır. Bu yazıda, inguinal lenf nodlarının boyut (hacim) artışının uzunlamasına izlenmesi için ultrason görüntülemenin (Şekil 1) kullanımı, elde edilen verilerin müteakip 3D hacimsel analizi ile birlikte açıklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada elde edilen veriler, ultrason görüntülemenin metastatik melanomun Braf/Pten fare modelinin inguinal lenf nodlarının metastatik tutulumunu izleme yeteneğini kanıtlamaktadır. Daha önce gösterildiği gibi16, bu teknik özellikle ilaç tedavisinin etkinliğini değerlendirmek için yararlıdır. Bunun nedeni, t1 ve t2’de toplanan ölçümleri t0’da toplananlarla karşılaştırarak, aynı hayvandaki lenf nodu hacmindeki değişimi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, hayvan prosedürleri konusundaki yardımları için S. Burchielli’ye (FTGM, Pisa) teşekkür eder. Bu çalışma ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica tarafından LP’ye kurumsal fon sağlanarak desteklenmiştir; MFAG #17095, AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro tarafından LP’ye verildi.
Materials
| 4-hydroxytamoxifen | Merck | H6278 | drug used for tumor induction |
| B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice | The Jackson Laboratory | 013590 | |
| Blu gel | Sooft Ialia | ophthalmic solution gel | |
| BRAFV600E antibody | Spring Bioscience Corporation | E19290 | |
| IsoFlo (isoflorane) | Zoetis | liquid for gaseous anaesthesia | |
| MLANA antibody | Thermo Fisher Scientific | M2-7C10 | |
| Sigma gel | Parker | electrode gel | |
| Transonic gel clear | Telic SAU | ultrasound gel | |
| Veet | Reckitt Benckiser IT | depilatory cream | |
| Compact Dual Anesthesia System | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber | |
| MX550S | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS linear probe | |
| Vevo 3100 | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS system | |
| Vevo Imaging Station | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board | |
| Vevo Lab | Fujifilm, Visualsonics Inc. | software platform for ultrasound image post-processing |
References
- Schvartsman, G., et al. Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663 (2019).
- Blum, A., et al. Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma – Results of a prospective study of 1288 patients. Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).
- Olmedo, D., et al. Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis. Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).
- Voit, C., et al. Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma. Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).
- Hayes, A. J., et al. Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma. British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).
- Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients. Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).
- Jayapal, N., et al. Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, 338-346 (2019).
- Dankort, D., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
- Damsky, W. E., et al. β-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas. Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).
- Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma. Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).
- Kohler, C., et al. Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes. Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).
- Yuan, P., et al. Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).
- Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).
- Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma. American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).
- Steinberg, S. M., et al. BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma. Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).
- Vitiello, M., et al. Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma. Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).
- Moon, H., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma. Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).
