Modellering beroerte bij muizen: transiënte middelste cerebrale arterie occlusie via de externe halsslagader
Summary
Verschillende modellen van middelste cerebrale arterie occlusie (MCAo) worden gebruikt in experimenteel beroerteonderzoek. Hier wordt een experimenteel beroertemodel van voorbijgaande MCAo via de externe halsslagader (ECA) beschreven, dat tot doel heeft een menselijke beroerte na te bootsen, waarbij de cerebrovasculaire trombus wordt verwijderd als gevolg van spontane stolsellysis of therapie.
Abstract
Beroerte is de derde meest voorkomende oorzaak van sterfte en de belangrijkste oorzaak van verworven volwassen invaliditeit in ontwikkelde landen. Tot op heden zijn therapeutische opties beperkt tot een klein deel van de patiënten met een beroerte binnen de eerste uren na een beroerte. Nieuwe therapeutische strategieën worden uitgebreid onderzocht, vooral om het therapeutische tijdvenster te verlengen. Deze huidige onderzoeken omvatten de studie van belangrijke pathofysiologische routes na een beroerte, zoals ontsteking na een beroerte, angiogenese, neuronale plasticiteit en regeneratie. In het afgelopen decennium is er toenemende bezorgdheid over de slechte reproduceerbaarheid van experimentele resultaten en wetenschappelijke bevindingen bij onafhankelijke onderzoeksgroepen. Om de zogenaamde “replicatiecrisis” te overwinnen, zijn gedetailleerde gestandaardiseerde modellen voor alle procedures dringend nodig. Als een inspanning binnen het “ImmunoStroke” onderzoeksconsortium (https://immunostroke.de/), wordt een gestandaardiseerd muismodel van transiënte midden cerebrale arterie occlusie (MCAo) voorgesteld. Dit model maakt het volledige herstel van de bloedstroom mogelijk na verwijdering van het filament, waarbij de therapeutische of spontane stolsellysis wordt gesimuleerd die optreedt bij een groot deel van de menselijke beroertes. De chirurgische procedure van dit “filament” beroertemodel en hulpmiddelen voor de functionele analyse ervan worden gedemonstreerd in de bijbehorende video.
Introduction
Beroerte is wereldwijd een van de meest voorkomende oorzaken van overlijden en invaliditeit. Hoewel er voornamelijk twee verschillende vormen van beroerte zijn, ischemisch en hemorragisch, is 80-85% van alle gevallen van beroerte ischemisch1. Momenteel zijn er slechts twee behandelingen beschikbaar voor patiënten met ischemische beroerte: farmacologische behandeling met recombinant weefselplasminogeenactivator (rtPA) of mechanische trombectomie. Vanwege het smalle therapeutische tijdvenster en de meervoudige exclusiecriteria kan echter slechts een select aantal patiënten profiteren van deze specifieke behandelingsopties. In de afgelopen twee decennia heeft preklinisch en translationeel beroerteonderzoek zich gericht op de studie van neuroprotectieve benaderingen. Alle verbindingen die klinische onderzoeken hebben bereikt, hebben tot nu toe echter geen verbeteringen voor de patiënt laten zien2.
Omdat in vitro modellen niet alle herseninteracties en pathofysiologische mechanismen van beroerte nauwkeurig kunnen reproduceren, zijn diermodellen cruciaal voor preklinisch beroerteonderzoek. Het nabootsen van alle aspecten van menselijke ischemische beroerte in een enkel diermodel is echter niet haalbaar, omdat ischemische beroerte een zeer complexe en heterogene ziekte is. Om deze reden zijn er in de loop van de tijd verschillende ischemische beroertemodellen ontwikkeld bij verschillende soorten. Fototrombose van cerebrale arteriolen of permanente distale occlusie van de middelste hersenslagader (MCA) zijn veelgebruikte modellen die kleine en lokaal gedefinieerde laesies induceren in de neocortex3,4. Daarnaast is het meest gebruikte slagmodel waarschijnlijk het zogenaamde “filamentmodel”, waarbij een voorbijgaande occlusie van MCA wordt bereikt. Dit model bestaat uit een voorbijgaande introductie van een hechtdraadfilament aan de oorsprong van de MCA, wat leidt tot een abrupte vermindering van de cerebrale bloedstroom en het daaropvolgende grote infarct van subcorticale en corticale hersengebieden5. Hoewel de meeste slagmodellen MCA-occlusies 6nabootsen, maakt het “filamentmodel” een nauwkeurige afbakening van de ischemische tijd mogelijk. Reperfusie door filamentverwijdering bootst het menselijke klinische scenario na van cerebrale bloedstroomherstel na spontane of therapeutische (rtPA of mechanische trombectomie) stolsellysis. Tot op heden zijn verschillende modificaties van dit “filamentmodel” beschreven. In de meest voorkomende benadering, voor het eerst beschreven door Longa et al. in 19895, wordt een met silicium gecoat filament via de gemeenschappelijke halsslagader (CCA) geïntroduceerd bij de oorsprong van de MCA7. Hoewel het een veel gebruikte aanpak is, laat dit model geen volledig herstel van de bloedstroom toe tijdens reperfusie, omdat de CCA permanent wordt geligeerd na verwijdering van het filament.
In het afgelopen decennium zijn steeds meer onderzoeksgroepen geïnteresseerd in het modelleren van beroerte bij muizen met behulp van dit ‘filamentmodel’. De aanzienlijke variabiliteit van dit model en het gebrek aan standaardisatie van de procedures zijn echter enkele van de redenen voor de hoge variabiliteit en slechte reproduceerbaarheid van de experimentele resultaten en wetenschappelijke bevindingen die tot nu toe zijn gerapporteerd2,8. Een mogelijke oorzaak van de huidige “replicatiecrisis”, verwijzend naar de lage reproduceerbaarheid onder onderzoekslaboratoria, zijn de niet-vergelijkbare beroerte-infarctvolumes tussen onderzoeksgroepen die dezelfde experimentele methodologie gebruiken9. Na het uitvoeren van de eerste preklinische gerandomiseerde gecontroleerde multicenter studie10, konden we bevestigen dat het gebrek aan voldoende standaardisatie van dit experimentele beroertemodel en de daaropvolgende uitkomstparameters de belangrijkste redenen waren voor het falen van de reproduceerbaarheid in preklinische studies tussen onafhankelijke laboratoria11 . Deze drastische verschillen in de resulterende infarctgroottes vormen, ondanks het gebruik van hetzelfde beroertemodel, terecht niet alleen een bedreiging voor bevestigend onderzoek, maar ook voor wetenschappelijke samenwerkingen vanwege het gebrek aan robuuste en reproduceerbare modellen.
In het licht van deze uitdagingen wilden we de procedure voor een gestandaardiseerd transiënt MCAo-model ontwikkelen en in detail beschrijven, zoals gebruikt voor de gezamenlijke onderzoeksinspanningen binnen het onderzoeksconsortium “ImmunoStroke” (https://immunostroke.de/). Dit consortium heeft tot doel de hersen-immuuninteracties te begrijpen die ten grondslag liggen aan de mechanistische principes van beroerteherstel. Daarnaast worden histologische en gerelateerde functionele methoden voor de analyse van beroerte-uitkomsten gepresenteerd. Alle methoden zijn gebaseerd op vastgestelde standaard operationele procedures die worden gebruikt in alle onderzoekslaboratoria van het ImmunoStroke-consortium.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het huidige protocol beschrijft een experimenteel beroertemodel op basis van de consensusovereenkomst van een Duits multicenter onderzoeksconsortium (“ImmunoStroke”) om een gestandaardiseerd transiënt MCAo-model vast te stellen. Het transiënte MCAo-model dat tot stand is gebracht door een met silicium gecoat filament via de ECA te introduceren bij de oorsprong van de MCA, is een van de meest gebruikte slagmodellen om arteriële reperfusie te bereiken na een afgebakende occlusieperiode. Daarom kan deze procedure worden …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken al onze samenwerkingspartners van de ImmunoStroke Consortia (FOR 2879, From immune cells to stroke recovery) voor suggesties en discussies. Dit werk werd gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) in het kader van de Duitse excellentiestrategie in het kader van de Münchense cluster voor systeemneurologie (EXC 2145 SyNergy – ID 390857198) en onder de subsidies LI-2534/6-1, LI-2534/7-1 en LL-112/1-1.
Materials
| 45° ramp | H&S Kunststofftechnik | height: 18 cm | |
| 5/0 threat | Pearsalls | 10C103000 | |
| 5 mL Syringe | Braun | ||
| Acetic Acid | Sigma Life Science | 695092 | |
| Anesthesia system for isoflurane | Drager | ||
| Bepanthen pomade | Bayer | ||
| C57Bl/6J mice | Charles River | 000664 | |
| Clamp | FST | 12500-12 | |
| Clip | FST | 18055-04 | |
| Clip holder | FST | 18057-14 | |
| Cotons | NOBA Verbondmitel Danz | 974116 | |
| Cresyl violet | Sigma Life Science | C5042-10G | |
| Cryostat | Thermo Scientific CryoStarNX70 | ||
| Ethanol 70% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 521005 | |
| Ethanol 96% | CLN Chemikalien Laborbedorf | 522078 | |
| Ethanol 99% | CLN Chemikalien Laborbedorf | ETO-5000-99-1 | |
| Filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Fine 45 angled forceps | FST | 11251-35 | |
| Fine forceps | FST | 11252-23 | |
| Fine Scissors | FST | 14094-11 | |
| Glue | Orechseln | BSI-112 | |
| Hardener Glue | Drechseln & Mehr | BSI-151 | |
| Heating blanket | FHC DC Temperature Controller | ||
| Isoflurane | Abbot | B506 | |
| Isopentane | Fluka | 59070 | |
| Ketamine | Inresa Arzneimittel GmbH | ||
| Laser Doppler | Perimed | PF 5010 LDPM, Periflux System 5000 | |
| Laser Doppler probe | Perimed | 91-00123 | |
| Phosphate Buffered Saline pH: 7.4 | Apotheke Innestadt Uni Munchen | P32799 | |
| Recovery chamber | Mediheat | ||
| Roti-Histokit mounting medium | Roth | 6638.1 | |
| Saline solution | Braun | 131321 | |
| Scalpel | Feather | 02.001.30.011 | |
| Silicon-coated filaments | Doccol | 602112PK5Re | |
| Stereomicropscope | Leica | M80 | |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Vannas Spring Scissors | FST | 15000-00 | |
| Xylacine | Albrecht |
References
- Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. Stroke. Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).
- O’Collins, V. E., et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques. Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).
- Zhang, Z., et al. A new rat model of thrombotic focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 17 (2), 123-135 (1997).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice – middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423 (2011).
- Dirnagl, U., et al. A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research. Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).
- McNutt, M. Journals unite for reproducibility. Science. 346 (6210), 679 (2014).
- Llovera, G., et al. Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia. Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).
- Llovera, G., Liesz, A. The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial. Journal of Neurochemistry. 139, 271-279 (2016).
- Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987. Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).
- Lourbopoulos, A., et al. Inadequate food and water intake determine mortality following stroke in mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2084-2097 (2017).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).
- Jackman, K., Kunz, A., Iadecola, C. Modeling focal cerebral ischemia in vivo. Methods in Molecular Biology. 793, 195-209 (2011).
- Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).
- Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4038 (2012).
- Rha, J. H., Saver, J. L. The impact of recanalization on ischemic stroke outcome: a meta-analysis. Stroke. 38 (3), 967-973 (2007).
- Liu, J., et al. Transient filament occlusion of the middle cerebral artery in rats: does the reperfusion method matter 24 hours after perfusion. BMC Neuroscience. 13, 154 (2012).
- Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. A rotarod suitable for quantitative measurements of motor incoordination in naive mice. Naunyn-Schmiedebergs Archiv für Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 259 (2), 211 (1968).
- Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4 (10), 1560-1564 (2009).
- Zhang, L., et al. A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia. Journal of Neuroscience Methods. 117 (2), 207-214 (2002).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39 (5), 777-787 (2000).
- Roth, S., Yang, J., Cramer, J., Malik, R., Liesz, A. Detection of cytokine-induced sickness behavior after ischemic stroke by an optimized behavioral assessment battery. Brain, Behavior, and Immunity. 91, 668-672 (2021).
